四倍体刺槐关键抗性机制研究

第1章四倍体刺槐研究概述 1.1 四倍体刺槐抗逆性方面的研究 四倍体刺槐是从韩国引进的优良树种，主要以抗旱、耐盐、生长迅速为特点，国内很多学者已经针对其抗逆性进行了研究。四倍体刺槐的抗逆性多集中在抗盐和耐旱两个方面。例如，张怡（ 2005）设置了模拟自然干旱和土壤逐渐干旱两种处理，以普通二倍体刺槐为对照，研究了三个品种的一年生组培苗与抗旱性相关的生理生化指标的差异。结果表明：干旱胁迫下，四倍体刺槐具有较大的生物量，尤其是饲料型四倍体刺槐能保持较优的根冠比和载叶量。两个四倍体品种的水分利用效率（ WUE）无论在哪种干旱处理方式下都显著优于二倍体，说明在同等供水条件下，四倍体品种有较大生物量的产出。稳定碳同位素组成与生物量相关性较好，可以作为筛选指标。同时，在干旱胁迫下，四倍体刺槐能保持较高的光合效率。此外，为了扩繁种苗，还针对四倍体刺槐进行了不同外植体的培养基筛选（表 1-1）。 表 1-1 四倍体刺槐不同外植体的培养基筛选 注：“—”表示未提及。 6-BA为细胞分裂素 6-苄基腺嘌呤； NAA为萘乙酸；IAA为吲哚-3-乙酸；IBA为吲哚-3-丁酸；MS为植物基本培养基； WPM为木本培养基 温阳等（ 2006）利用引进的饲料型四倍体刺槐在内蒙古呼和浩特进行栽培，并在内蒙古中部的半干旱区山地、黄土沟壑区、盐碱覆沙地等 3种不同立地类型造林，进行了 4年抗寒、抗旱、抗病虫害、生长适应性等一系列大田观察测定，同时对该树种进行了抗旱特性分析，结果表明：饲料型四倍体刺槐具有较强抗逆特性，内蒙古半干旱区山地是适宜其种植的立地类型。采用抗旱造林技术，可以栽培四倍体刺槐，进一步说明了其适应地区较为广泛，而且在风沙较大、干旱程度较为严重的内蒙古地区仍然有较强适应性。 尽管四倍体刺槐具有一定程度的耐盐性，但是为了进一步提高四倍体刺槐的耐盐性，有研究者对四倍体刺槐进行了抗盐基因的转化。例如，王文强（ 2003）为了进一步提高四倍体刺槐的耐盐性，利用基因工程对四倍体刺槐进行了进一步的耐盐性改良，从而提高了四倍体刺槐的耐盐、抗旱能力，主要方法是在已建立的四倍体刺槐高频组培再生体系基础上，进行了农杆菌介导的甜菜碱醛脱氢酶基因（BADH）的转化研究，在组培条件下进行了转基因植株的耐盐性检测，并对转基因植株进行了 NaCl抗性试验，结果表明： BADH基因在转基因植株中得到了表达，转基因植株比未转化植株具有更强的耐盐性，同时也进一步证明了 BADH基因转化的成功。 此外，张怡等（ 2009）在模拟自然干旱的条件下，测定了两个四倍体刺槐品种和普通二倍体刺槐一年生组培苗的长期及瞬时水分利用效率及其稳定碳同位素组成，以探讨四倍体刺槐的抗旱机制。结果表明：四倍体品种 K2、K3的长期水分利用效率在不同水分胁迫条件下都显著高于二倍体品种 K1，它们在同等供水条件下比 K1具有更大的生物量产出； 3个材料叶片的瞬时水分利用效率均随干旱胁迫的加剧表现出先升后降的趋势，且胁迫处理均高于适宜水分处理。随水分胁迫的加剧，各品种刺槐苗木叶片的 δ13C显著升高；K2、K3的 δ13C在各水分条件下均高于 K1；各材料叶片的 δ13C与其水分利用效率有良好的正相关性，可以作为筛选高 WUE刺槐品种的指标。 王建国等（ 2010）根据银川市的盐碱地、干旱荒漠地面积大的特征，同时在这些地段存在造林难度大，成活率低、保存率更低，树木成活了也不易健康生长的弊端，因此增大了造林成本，认为引种驯化耐盐碱、耐干旱、抗病虫的树种对于提高造林成活率意义重大。银川市林业技术推广站于 2004年引进中天杨、碧玉杨、苏柳 172、四倍体刺槐，利用其速生、易繁殖、适应性强等特点在盐碱、干旱、荒漠地带造林，经过观测，所引树种已经适应了银川市的立地条件和气候条件，尤其是四倍体刺槐的 5个无性系（分为用材型和饲料型两类）。 1.2 四倍体刺槐组培快繁技术方面的研究 四倍体刺槐根萌蘖性较强、根系发达，自身含有丰富的根瘤菌，可提升土壤内有机质含量、改良土壤、形成土壤团粒结构，还具有耐低温、耐贫瘠、速生丰产特性，在治理沙漠化、防风固沙、水土保持和绿化上具有优势，而且属于优质蜜源植物，有利于促进地方养蜂业发展，经济效益和生态效益显著。但是四倍体刺槐存在扦插繁殖困难的问题，因此需要进行组培以提高其繁殖率，所以研究四倍体刺槐的组培快速繁殖技术，是对其进行大量推广应用的前提。也就是说，为确保优良四倍体刺槐品种的快速繁殖，对其进行组织培养、加强快繁的研究具有重要的实际意义，可进一步增加推广面积，发挥四倍体刺槐的生态价值。 其中，饲料型四倍体刺槐是由北京林业大学于 1997年从韩国引入中国的刺槐优良无性系，主要是利用人工诱导二倍体刺槐（ 2n）体细胞加倍（ 4n）选育而成。四倍体刺槐的叶片表现为宽大肥厚、蛋白质含量较高、柔嫩多汁、适口性较好，可作为优良的饲料树种，发展畜牧业。同时，其耐干旱瘠薄、适应性强、生物量大、萌蘖性强、根系发达、根瘤可固氮的特性较为突出，可以作为水土保持、防风固沙、改良土壤、营造饲料型灌木林的优良树种；发展饲料型四倍体刺槐对加快中国林业生态建设、促进畜牧业及饲料加工业的发展具有重要的现实意义。自饲料型四倍体刺槐引入我国以来，很多国内学者对四倍体刺槐的经济性状、关键造林育苗技术、主要组织培养技术和重要的遗传转化技术方法等方面进行了广泛的研究，特别是在组培技术研究方面做了大量工作，且这些工作主要集中在对茎尖、侧芽以及叶片等器官组培技术的研究上。 因此，长时间以来针对四倍体刺槐的组培研究已有了较多报道。其中，进行组培快繁技术研究，选择合适的外植体是关键，其次是增殖培养基和生根培养基的筛选。以下针对四倍体刺槐的这三个方面进行综合论述。 郭军战等（2002）以四倍体刺槐 2个无性系为材料，研究了四倍体刺槐不同外植体与不同消毒方法对离体组织培养的影响，试验结果表明：室内水培枝和室外枝条的中下部均可作为离体培养的良好材料，外植体昀佳长度为 1.0～2.0cm；用 70%乙醇溶液消毒 30s后，再用 0.1% HgCl2消毒 8～10min，消毒效果昀好，但是由于 HgCl2毒性较大，因此在应用时应该加以防护和注意。 张怡等（ 2009）于 2004年春季刺槐芽萌发前，剪取当年生枝条，放入人工气候箱内水培。培养条件为：温度 28℃、相对湿度 70%～90%、光照强度 3000lx；水培期间每天换水。剪取枝条上新长出的 2～3cm带腋芽茎段作为外植体。用毛笔蘸药皂水轻轻刷洗外植体，流水冲洗 1h后用体积分数为 70%的乙醇溶液表面消毒 30s，立即用适量有效氯含量为 0.5%的 NaClO溶液灭菌 4～5min，然后用无菌水冲洗 5～6次。将灭菌的外植体接种到含 30g/L蔗糖和 6g/L琼脂的 MS培养基（ pH5.8）上，每瓶 1个外植体，置于温度（ 25±2）℃、相对湿度约 60%、光照强度3000lx、光照时间 14h的环境中。结果发现：培养 1周后四倍体刺槐无性系 K2和 K3外植体的污染率分别为 6.7%和 3.3%，成活率均达 90%；外植体的灭菌致死率分别为 3.3%和 6.7%。可见：通过水培催芽得到的 K2和 K3的嫩芽及带芽茎段，由于污染率低且萌发启动快而成为昀佳外植体。从环保角度考虑，选择有效氯含量为 0.5%的 NaClO溶液替代 HgCl2，配合体积分数为 70%的乙醇溶液作为消毒剂，外植体的灭菌效果良好。 黄立华和朱虹（2009）于 4月中旬，在辽宁省干旱地区造林研究所的良种刺槐引种栽培基地内，剪取速生型和饲料型四倍体刺槐的较嫩且带腋芽茎段。先将茎段剪成长 15cm左右，然后将其放入加有洗衣粉的洗涤液中浸泡 10min，用毛刷细致刷洗茎段和腋芽，再用自来水冲洗 2～3h。将外植体移入超净工作台，放入 75%乙醇溶液中消毒 1min，用无菌水冲洗 3次。继而以 0.1%的氧化汞表面消毒12min，无菌水冲洗 5次。取出一茎段将其放在经过高温灭菌的吸水纸上，吸干表面水分后，在无菌纸上将其剪成长 1～2cm带腋芽茎段，供接种使用。 尽管针对四倍体刺槐进行了大量的研究，但是其组培生根仍是关键所在。在相同的培养条件下，叶景丰和姜忠灏（ 2004）对四倍体刺槐生根情况进行了系统分析，发现：不同质量的组培瓶苗生根和生长状况有着明显差异。Ⅱ级苗生根率比Ⅰ级苗高 23.3%，比Ⅲ级苗高 33.3%，并且Ⅱ级苗在生根培养过程中生长健壮，而Ⅰ级苗在生根培养过程中有黄叶和落叶现象，说明无论苗过大或过小，生根效果都不理想，因此继代培养时，当组培瓶苗达Ⅱ级苗标准时，是生根的昀佳时期。同时发现：单独使用 NAA诱导生根，随 NAA浓度的增加，生根率和有效根指数分别由 50%和 1.78下降到 23.3%和 0.89。说明 NAA浓度高时，对四倍体刺槐的组培苗生根有一定的抑制作用。相反，单独使用 IBA诱导生根时，随 IBA浓度增加，生根率和有效根指数分别由 21.7%和 2.19上升到 63.3%和 3.73。同时，刘丹梅等（2007）应用正交设计法研究了 6-BA、NAA及琼脂等 3个因子对四倍体刺槐组培苗生根率的影响，试验按正交表 L16（45）形成 3因素、 4水平的不同配比。试验结果表明：昀佳的增殖培养基是 1/2MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+琼脂 6g/L。 曹善东（2003）试验筛选出的四倍体刺槐增殖培养基为：①MS+6-BA 1.0mg/L+ NAA 0.02mg/L；②MS+6-BA 1.0mg/L+IAA 1.0mg/L。生根培养基为不加任何激素的 MS培养基和 MS+NAA 0.01mg/L培养基。它们具有使四倍体刺槐组培苗生长势好、繁殖系数高、生根早、生根数量多、根系粗壮的优点。 王莉等（ 2004）还发现：芽诱导培养形成的茎段，需要通过施加外源生长素来促进发根，但是因为生长素的“双重作用”，即较低浓度生长素可促进生长，高浓度的情况下对生长有抑制作用，所以施加外源生长素必须注意昀适浓度的确定，以防止浓度过低或过高时影响试管苗发根时间及根系质量。同时适宜的 NAA用量，既可以促进组培苗的提早发根，又可以促进须根的形成，从而提高苗木成活率。植物离体器官的组织培养是在植物激素的调节控制下进行的，苗木常因培养基中激素的配比不同而表现出生长势差异。除了利用叶片以及茎段进行了四倍体刺槐的组培研究之外，姜金仲等（ 2006）还利用饲料型四倍体刺槐的花器作为研究材料，进行了组培的相关研究。通过把这些不同解剖结构接种到不同激素浓度的 MS培养基上进行培养，得出了初步的趋势性结论。 李晓青等（2008）以四倍体刺槐春季萌发的嫩枝带芽茎段为试材制备外植体，进行组培快繁试验。结果表明：昀佳启动培养基为 MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.3mg/L，昀佳增殖培养基为 MS+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.3mg/L，昀佳生根培养基为 1/2MS+IBA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L。移栽时注意遮阴和控制温湿度，成活率达 90%。 蒋祥娥等（ 2006）对速生型四倍体刺槐进行了组织培养及健化技术的研究，在不定芽的诱导中，以 MS、1/2MS、LS、1/2LS为基本培养基，在各培养基中，以 MS+BAP①0.2mg/L+NAA 0.05mg/L的组合生长情况昀好，但随着继代次数的增加，其细胞分裂素要逐步降低。在生根培养中，以 1/2MS+NAA 0.05mg/L+IBA 0.01mg/L生根*好，在苗木健化中，其成活率达 73.4%。 李云（2004）通过茎段离体培养建立了四倍体刺槐无性系的微体繁殖体系。结果表明：基本培养基为 MS或 WPM培养基。BA、NAA影响芽的增殖生长，在一定的范围内，BA对芽的增殖影响比 NAA大，而 NAA对芽的高生长影响比 B