微生物学实验教程(第3版)

绪论 微生物学实验的目的是了解和阐明微生物的生物学特性和感染及宿主抗感染免疫机制，对感染性疾病进行早期、快速和特异性诊断及有效治疗和预防，以控制和消灭各种微生物引起的感染及感染相关疾病。 对于感染性疾病及其各种影响因素的诊断和鉴别诊断，不仅需要临床医生对患者的症状、体征、病史等情况进行充分调查与了解，还需要依赖微生物学实验技术对患者标本进行实验室检查。 一、微生物学实验室诊断的原理 感染性疾病的微生物学实验室诊断又称病原学诊断（etiological diagnosis），是通过病原体分离鉴定、病原体的抗原及其免疫效应物质检测、病原体特异性分子物质检测，对感染性疾病的发生、发展及预后进行分析、诊断和预测的策略与方法。用微生物学实验技术，对感染性疾病进行实验室诊断的原理包括： 1. 患者体内有病原体及毒性代谢产物　某种病原性微生物侵入人体生长繁殖和引起感染性疾病，这种病原体及其毒性代谢产物可在患者体内大量存在。因此，采用微生物学实验技术，常常能够在患者的病灶组织内发现或检出相应病原体及其毒性代谢产物，从而对感染性疾病进行病原学诊断与鉴别诊断。 2. 患者体内有病原体抗原及其相应免疫应答产物　各种病原体都具有其特异性的抗原物质，也可具有某些共同抗原、交叉抗原或异嗜性抗原。病原体的这些抗原可刺激宿主机体发生免疫应答，引起宿主产生相应抗体和（或）致敏淋巴细胞。因此，可通过检测病原体特异性抗原或其相关抗原、检测病原体特异性抗原或其相关抗原的免疫应答产物及其效价或活性，对感染性疾病进行免疫学诊断与鉴别诊断。 3. 患者体内有病原体特异性分子　各种微生物可含有其独特的或特异性的分子，这些分子不但可随微生物感染而存在于宿主体内，也可引起宿主产生某些特异性的或相关的分子。微生物特异性的及其相关的分子可通过分子生物学方法检测，对感染性疾病进行分子生物学诊断。 二、微生物学实验室诊断的内容与程序 根据感染性疾病发生与发展的基本原理，微生物感染的实验室诊断内容主要包括以下4个方面：①标本采集与送检；②分离鉴定病原体（病原体检查）；③检测病原体抗原及其免疫效应物质（免疫学检查或血清学检查）；④检测病原体分子（分子生物学检查）。 1. 标本采集与送检　感染人体的病原体在病程的不同时期可存在于宿主不同的组织或器官内，并且可通过一定的途径在宿主体内扩散或排出宿主体外。这些病原体的抗原可使宿主产生免疫应答，使其产生特异性抗体和（或）致敏淋巴细胞。因此，在患者病程的不同时期，根据病原体在患者体内的分布规律和排出途径而采集的不同标本，可有助于相应病原体的检出。根据免疫应答的规律采集血清、血液等标本，可有助于特异性免疫效应物质的检测。标本采集的基本原则包括： （1）做好标记：采集标本之前，须首先在标本容器（或大体标本）上做好各种相关的标记，并且在病原学检查申请书上尽可能详细地填写相关内容。所做标记必须字迹清晰、附着牢固、内容简要、含义明确、具有独特性。标本的规范标记不但能够避免标本传送过程可能造成的混淆或错误，也有助于检验医生根据患者及其疾病的相关信息确定实验室检查的方法与重点内容，并对检验结果进行正确分析与判断。一般来说，标记和申请书的基本内容主要包括患者姓名、性别、年龄，疾病诊断及其相关的简要病史，门诊或住院科室、编号，标本采集日期，检查内容、抗菌药物使用及其他相关或特殊要求。 （2）无菌操作：外界环境及人体的微生物可在采集标本的过程中污染标本或其容器，因此需要严格的无菌操作以减少、防止或避免这些微生物污染标本。虽然消毒与灭菌可有助于减少或防止微生物污染或提高无菌操作的效果，但其绝不等于、也不能替代无菌操作。对环境、器材或患者局部组织的消毒或灭菌，甚至还可对病原体的分离培养产生不利影响。 （3）及时送检：某些病原体在宿主体外容易死亡，污染标本的微生物也可大量生长繁殖而干扰病原体的检查。因此，采集的标本不宜长时间放置，需要及时送到实验室并及时进行病原体的检查或分离培养。 （4）妥善保藏：不能及时送检的标本需要妥善保藏，但保藏的条件需要根据待检微生物的性质进行选择与确定。例如，用于分离培养无芽孢厌氧菌的标本，需要在厌氧条件下保藏；用于分离培养病毒的标本，需要在–20℃以下的低温条件保藏；用于分离培养肠道杆菌的粪便标本，可置于30%甘油缓冲盐水内在4℃条件下保藏；用于分离培养淋病奈瑟菌的标本，需要立即接种于营养培养基并在37℃条件下保藏。 （5）根据病原体的分布和排出途径采集标本：在病程的不同时期，病原体可大量存在于宿主的不同组织或器官内并通过不同途径排出。存在于宿主组织或器官内的病原体大量生长繁殖，也常常可引起该组织或器官发生明显的病理损害。因此，根据病原体在宿主体内的分布与排出规律，采集明显病变部位的标本，可有助于提高检出率。 （6）使用抗菌药物之前采集标本：使用抗菌药物后，患者各组织内含有较高浓度的抗菌药物，从而可抑制病原体在培养基内生长繁殖而影响分离培养效果。因此，感染性疾病的标本采集需要在患者使用抗菌药物之前。如果患者已经使用了抗菌药物，则可采用添加相应拮抗剂或中和剂及过滤等方法，降低或消除培养物内的抗菌药物活性。 （7）根据免疫应答规律采集标本：检测抗体或致敏淋巴细胞，需要根据免疫应答的规律分别采集感染初期（急性期）和后期（恢复期）的标本。例如，检测抗体，只有当恢复期特异性抗体效价增高，并且达到急性期抗体效价4倍或以上时，才具有诊断意义。但如果检测血清特异性IgM抗体，感染初期（急性期）的抗体效价增高即有助于诊断。 2. 病原体检查　病原体检查是通过微生物学实验室技术方法，检查和鉴定引起感染的病原体种类，为临床进一步诊断、鉴别诊断、治疗和预防提供参考依据。分离鉴定病原体的基本内容和操作程序主要包括涂片镜检、病原体分离、病原体鉴定、病原体药物敏感实验。 （1）涂片镜检：标本可置于载玻片上直接镜检，也可染色后镜检。涂片镜检的意义有： 1）早期初步诊断：通过对病原体形态、结构及染色的观察，可在形态学上初步识别病原体的类别，从而有助于疾病的早期初步诊断。 2）早期治疗：通过对病原体形态学类别的初步识别，有助于临床根据病原体的类别早期选择和使用抗菌药物对患者进行治疗。 3）分离培养结果的分析：涂片镜检发现病原体，但分离培养没有发现病原体或没有检出相应病原体，可考虑厌氧菌感染、培养物含抑制病原体生长的因素或受到其他病原体污染。 4）治疗效果评估：病原体形态和数量的变化，有助于判断抗菌药物治疗的效果。例如，在结核病患者标本涂片抗酸染色镜检中发现不典型形态的抗酸杆菌及其数量明显减少，可提示抗结核药物治疗有效。在隐球菌感染患者标本涂片负染色镜检中发现不典型形态的隐球菌及其数量明显减少，但血清或脑脊液的特异性抗体效价升高，可提示疾病进入恢复期。 （2）病原体分离培养：包括人工培养基分离培养法和动物分离培养法，常用人工培养基分离培养法。人工培养基分离培养法是将标本接种于适当的培养基，并且在适当的温度、气体等条件下进行适当时间的培养。动物分离培养法是将标本接种于易感动物体内，从发病或濒死动物的体内分离病原体。 （3）病原体鉴定：鉴定病原体的属、种、型或株。常用方法包括： 1）生物学方法：常用生化反应的方法，检测病原体的酶及代谢活性。 2）血清学方法：常用特异性抗血清，通过凝集实验、沉淀实验、补体结合实验、标记抗体实验等方法，检测病原体的相应抗原。 3）分子生物学方法：常用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、分子印迹、分子杂交等技术方法，检测病原体特异性的核苷酸序列或蛋白质分子。 4）动物实验方法：将病原体感染实验动物，检测病原体的致病性或毒力。 （4）药物敏感性实验：通过测试病原体的药物敏感性检测病原体耐药性相关酶类或耐药性相关基因，分析和判断病原体的药物敏感性。临床常用琼脂纸片扩散法（K-B法）检测病原体的药物敏感性，用稀释法检测病原体的药物敏感性程度（*低抑制浓度与*低杀菌浓度）；用生物化学的技术方法检测病原体的耐药性相关酶类及其活性；用分子生物学的技术方法检测病原体的耐药性相关基因或耐药性相关蛋白质分子。 3. 免疫学检查　免疫学诊断的基本原则是检测病原体特异性的或相关的抗原、抗体和（或）致敏淋巴细胞，为临床进一步诊断和鉴别诊断及治疗和预防提供参考依据。免疫学诊断的基本内容和常用方法包括： （1）抗原检查：用已知特异性抗血清，通过体外或体内实验检测病原体的特异性抗原。体外检测病原体抗原的方法包括环状沉淀实验（ring precipitation test）、玻片凝集实验（slide agglutination test）、试管凝集实验（tube agglutination test）、荚膜肿胀实验（capsule swelling test）、补体结合实验（complement fixation test）、酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、病毒血凝抑制实验（virus hemagglutina-tion inhibition test）、生长抑制实验（growth inhibition test）、代谢抑制实验（metabolic inhibition test）、免疫荧光实验（immunofluorescence test）、间接血凝实验（indirect hemagglutination test）等。 （2）抗体检查：用已知的病原体抗原，通过体外或体内实验检测相应的特异性抗体。体内检测抗体的常用方法包括锡克实验、速发型皮肤实验；体外检测抗体及其效价的常用方法包括沉淀实验、肥达实验（Widal test）、抗O实验（anti-O test）、补体结合实验（complement fixation test）、ELISA、微量免疫荧光实验（micro-immunofluores-cence test）、间接血凝实验、显微镜凝集实验（microscopic agglutination test）、病毒血凝抑制实验、冷凝集实验（cold agglutination test）、链球菌MG凝集实验（streptococcus MG agglutination test）、间接凝集实验（indirect agglutination test）、间接荧光抗体实验（indirect .uorescent antibody test）、外斐实验（Weil-Felix test）等。 （3）致敏淋巴细胞检查：指用已知的病原体抗原检测致敏淋巴细胞，体内检测致敏淋巴细胞的方法包括结核菌素实验、麻风菌素实验、布氏菌素实验；体外检测致敏淋巴细胞活性和（或）数量的方法包括淋巴细胞转化实验（lymphocyte transformation test）、移动抑制实验（migration inhibition test）、细胞毒实验（cytotoxicity test）、T细胞亚群检测（detection of T-cell subgroups）等。 4. 分子生物学检查　以分子生物学技术进行分子诊断的基本原则是从患者或感染者体内检测病原体特异性分子物质，为临床进一步诊断和鉴别诊断及治疗和预防提供参考依据。基本内容和常用方法包括： （1）核酸分子检测：体外检测标本内病原体DNA分子的特异性核苷酸片段或RNA分子。常用方法包括PCR、核苷酸序列测定（nucleotide sequencing）、基因芯片技术（gene chip technology）、核酸指纹图谱（DNA fingerprinting）、核酸原位杂交（nucle