病媒生物基因鉴定技术(精)

**篇 总论 **章 绪论 **节 基因鉴定技术概述 一、病媒生物鉴定方法 病媒生物是指能直接或间接传播疾病，危害、威胁人类健康的生物。广义的病媒生物包括脊椎动物和无脊椎动物，脊椎动物媒介主要是鼠形动物，属哺乳纲啮齿目动物；无脊椎动物媒介主要是昆虫纲的蚊、蝇、蟑螂、蚤、蠓等和蛛形纲的蜱、螨等。 病媒生物的种类繁多，形态多样。全世界已知的鼠有1700多种，我国有鼠200余种，其中能够对人类造成危害的约有60种。昆虫纲中的已知昆虫有100多万种，约占整个动物界的3/4，而且还在不断发现新的昆虫，其中部分种类能传播疾病，危害人畜健康。病媒生物鉴定对于了解病媒生物种群、分布、生物习性，以及制订和实施有针对性的防制措施十分重要。 病媒生物鉴定方法经历了形态学鉴定、细胞水平鉴定、生化分析鉴定、免疫学方法鉴定、基因检测鉴定等几个阶段。近年来，随着生物技术的不断发展，病媒生物鉴定方法也不断更新，基因检测鉴定方法在物种鉴定和溯源中起重要作用。 （一）形态学鉴定 形态学鉴定是指通过肉眼或借助仪器对生物外表形态如外观、体型、体色、结构等特性或者解剖特征进行鉴别。这种方法具有操作简单、方便直观、需要仪器少、文献资料多、鉴定周期短、不破坏标本等特点，只要保持昆虫标本的完整性，不同的人可进行多次重复的观察，必要时可与模式标本比对，以减少鉴定的误差。但是，形态学鉴定依赖于生物的外表形态特征，受标本和鉴定者诸多因素的影响，也存在局限性，表现为以下几点。 （1）样本外表形态特征的可塑性和遗传可变性导致生物个体差异而出现鉴定结果的不准确性。 （2）许多生物存在隐存分类单元，它们的外表形态特征区别不明显，难以通过外表形态特征区别隐存单元。 （3）许多生物属变态昆虫，不同的发育阶段具有不同的外表形态，某些发育阶段无特异的外表形态特征，故无法用于种属鉴定。 （4）成功鉴定和描述生物必须依赖于分类工作者丰富的专业知识和准确的鉴定能力，但形态学鉴定本身的局限性使得分类学者特别偏向某一领域，如昆虫、脊椎动物、线虫等，且目前从事专业分类鉴定工作的人员逐年稀少，专业工作者退休之后，他们积累的丰富经验和知识也随之流失，负责分类工作的队伍不断缩减，使得生物鉴定也面临巨大的挑战。 （5）鉴定一个物种可能涉及该物种的许多特征部位，任何一个部位的缺失或不完整都可能使得鉴定工作无法进行，因此生物在捕获、保藏或运输途中导致形态的不完整是分类工作者无法完成鉴定工作的另一障碍。因而迫切需要发展其他的鉴定方法，与形态学鉴定相辅相成，共同做好生物鉴定工作。 （二）细胞水平鉴定 细胞水平鉴定以生物体内染色体数目、形态等特征作为鉴定要点。染色体是遗传物质的载体，染色体变异会导致生物体发生遗传变异。一个物种的核型特征即染色体数目、形态是相对稳定的，可作为一种遗传标记来测定，但这类标记的数目很局限，同时操作时技术要求较高，不适宜普遍操作。 细胞水平用于种属鉴定在实验中经常联合使用两种方法：染色体分析是区分物种的*佳方法；同工酶电泳也是一种较好的诊断检测方法，且比染色体分析快。采用染色体染色技术就是使用特异性分子探针组合与某条染色单体杂交，从而识别特定的某条配对染色体并判断其种属特异性。 （三）生化分析鉴定 生化分析鉴定以生物体内的某些生化性状（血型、血清蛋白及同工酶）作为遗传标记，主要是通过对血浆和血细胞中可溶性蛋白和同工酶中氨基酸变化的检测，为生物种内遗传变异和种间亲缘关系提供有用信息。生化标记检测所用的蛋白质电泳具有经济、方便的特点，且标记本身的多态性比形态标记和细胞标记丰富，已被广泛应用于物种起源与分类研究中。但是，检测的标记（蛋白质和同工酶）不是遗传物质本身，而是基因的表达产物，受环境和发育状况的影响较大，决定了这种标记具有一定的局限性。 （1）蛋白质的主要变异体种类少。 （2）酶蛋白易于变性降解，分析所用的样本必须新鲜，因此，受分析材料采集的时间、空间限制，此类遗传标记的发展和应用也是有限的。 （四）免疫学方法鉴定 免疫学方法鉴定的原理：物种存在种属特异性抗体和抗原，不同物种抗体和抗原之间相互作用发生凝聚反应，其反应存在特异性，据此可以鉴定不同的物种。 对于组织碎屑等用形态学无法辨认的检材，免疫学方法鉴定有较好的效果。 免疫学方法鉴定的缺点是无法获得足够多种类动物的特异性抗体或抗原，特别是对于一些野生物种。另外，亲缘关系近的种属间常存在交叉反应，容易造成误判。 细胞、生化、免疫水平物种鉴定常用方法见表1-1。 表1-1 细胞、生化、免疫水平物种鉴定常用的方法 （五）基因检测鉴定 核酸作为生物遗传信息的主要载体，生物的生理、分化、形态、习性演变等无不以之为基础，因此用基因（DNA）来进行分类学研究，更能从根本上反映物种的差异，且不受发育阶段的限制，仅需少许组织样本即可，即使样本腐烂或残缺，理论上只要能提取到足够的DNA即可实现分类鉴定。 二、基因鉴定技术及其原理 基因鉴定就是通过一定的方法检测出物种个体间或种群间DNA片段上的差异，从而达到鉴定物种的目的。基因鉴定优点较多：不受环境或其他因素影响、多态性较高、能提供完整的遗传信息等。 目前常用的基因鉴定技术如下：限制性酶切片段长度多态性、随机引物扩增多态性DNA、扩增片段长度多态性、微卫星DNA、DNA序列分析、DNA条形码。 （一）限制性酶切片段长度多态性 限制性酶切片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技术于1980年由人类遗传学家 Bostein提出。它是**代DNA分子标记技术。 Donis-Keller利用此技术于1987年构建成**张人的遗传图谱。DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。 RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位，以及生物进化和分类的研究。 RFLP的原理：不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记，构建分子图谱。 当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA后，所切的片段类型不一样，因此，可将限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是 HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、XbaⅠ，而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是 RFLP研究的主要目标之一。 不同种生物之间的基因存在差异，同一种生物群体内个体之间也存在差异。生物群体中个体间差异的产生，一方面是由于营养、气候和疾病等，另一方面主要是由于遗传因素。若单纯以表型分类不能区分同一种生物的单个性状、单个基因，甚至单个碱基之间的差异，借助 RFLP技术就可以对这种差异进行研究。 1.RFLP技术的优点 （1）RFLP揭示的是DNA水平自然变异，其标记数目几乎是无限的。 （2）大部分标记为共显性：表现 RFLP的位点一般是单一序列，每个位点通常有两个等位基因（共显性）。遵循孟德尔遗传，因而 RFLP标记图也可用传统的基因标图方法来构建。 （3）生育期任何时间都可预测，不受环境影响：DNA分子水平标记没有发育阶段或器官的特异性，不受环境条件及基因相互作用的影响。 2.RFLP对技术要求较高，在操作时必须注意以下事项 （1）作为检测对象的DNA分子必须保持大分子，在抽提DNA的过程中避免人为地将DNA分子机械性切割成小片段的DNA，否则*终显示的 RFLP图谱可能是一种假象。 （2）在用限制性内切酶消化大分子DNA时，要使DNA被完全消化，否则所得的结果也不可靠。 （二）随机引物扩增多态性.DNA 随机引物扩增多态性DNA（random ampliffed polymorphism DNA，RAPD）标记是由美国的 Williams和 Welsh等于1990年利用聚合酶链式反应（PCR）技术发展起来的一种DNA多态性标记。它利用随机引物对目的基因组DNA进行 PCR扩增，产物经电泳分离后显色，分析扩增产物DNA片段的多态性， RAPD可以反映目的基因组相应片段由于碱基缺失、插入、突变和重排等所引发的DNA多态性。 由于随机引物在较低的复性温度下能与基因组DNA非特异性地结合，当相邻两个引物间的DNA小于2000bp时，就能够得到扩增产物。与 RFLP相比，RAPD具有很多优点。 （1）不需要了解研究对象基因组的任何序列，只需很少纯度不高的模板，就可以检测出大量的信息。 （2）无须专门设计 RAW反应引物，随机设计长度为8～10个碱基的核苷酸序列就可应用。 （3）操作简便，不涉及分子杂交、放射自显影等技术。 （4）只需要很少的DNA样本。 （5）不受环境、发育、数量性状遗传等的影响，能够客观地提示供试材料之间DNA的差异。可以检测出 RFLP标记不能检测的重复顺序区。 当然， RAPD技术有一定的局限性，它呈显性遗传标记（极少数共显性），不能有效区分杂合子和纯合子；易受反应条件的影响，某些情况下，重复性较差，可靠性较低，对反应的微小变化十分敏感，如聚合酶的来源、DNA不同提取方法、Mg2+浓度等，都需要严格控制。 （三）扩增片段长度多态性 扩增片段长度多态性（ampli.ed fragment length polymorphism，AFLP）是1993年荷兰科学家 Zabeau和 Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法。 AFLP是 RFLP与 PCR相结合的产物，其原理是先利用限制性内切酶水解基因组DNA产生不同大小的DNA片段，再使双链人工接头的酶切片段相连接，作为扩增反应的模板DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，*后在接头互补链的基础上添加1～3个选择性核苷酸作引物对模板DNA基因再进行选择性扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性。 引物由三部分组成：与人工接头互补的核心碱基序列、限制性内切酶识别序列、引物3′端的选择碱基序列（1～10bp）。接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列为结合位点。 该技术的独*之处在于所用的专用引物在不知道DNA信息的前提下就可对酶切片段进行 PCR 扩增。为使酶切浓度大小分布均匀，一般采用两个限制性内切酶，一个酶为多切点，另一个酶切点数较少，因而 AFLP分析产生的主要是由两个酶共同酶切的片段。AFLP结合了 RFLP和 RAPD两种技术的优点，具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点。但它的技术费用较高，对DNA的纯度和内切酶的质量要求也很高。 尽管AFLP技术诞生时间较短，但其可称为分子标记技术的又一次重大突破，被认为是一种十分理想、有效的分子标记技术。 （四）微卫星.DNA 微卫星DNA（microsatellite DNA）是1981年 Marsh.eld医学研究基金会的 James和俄勒冈健