分子医学课程群实验

**篇基础性实验模块 **部分生物化学与分子生物学实验 实验一蛋白质的定量测定 【实验目的】 （1）掌握微量移液器的使用。 （2）掌握分光光度计的使用。 （3）掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理及操作。 【实验原理】 1.分光光度分析技术原理分光光度法是以朗伯-比尔（Lambrt-Beer）定律为基础，建立起来的方法。一束单色光通过有色溶液介质时，由于溶液吸收了一部分光线（光能），通过光的强度（光线的量）会减弱，有色溶液介质厚度越大，浓度越髙透过溶液的单色光强度就越小。 设A为人射光强度，/为透过光强度，c为有色溶液的浓度。通常把+称为透光度r，若以百分数表示，则称为百分透光度，透光度的负对数称为光密度，用d表示，即 （1） 由实验和积分数据推导证明，当有色溶液的浓度不大时，光密度D与溶液浓度C和溶液厚度L的乘积成正比关系，这种关系称为朗伯-比尔定律，用数学式表达为 （2） 式中，K为一常数，其大小由溶液的性质和入射光的波长决定。 由上式可知，在其他条件相同时，溶液的浓度越大，或是液层越厚，则溶液对光的吸收越强（密度越大），而透光度则越小，因此，当一单色光通过同一有色物质的两种不同浓度的溶液时，可得出下列两式： （3） （4） 在分光分析时，溶液的厚度L是固定的（即比色杯厚度相同），因此，L1=L2，合并（3）（4）即又因为是同一种物质的有色溶液，所以K1=K2，则 求未知浓度C2（C1为标准液浓度） 分光分析的原理是使透过溶液的光照射到光电池或光电管上，使光能转变为电能，产生电流。电流的大小与透过去的光的强度有关。因此，当产生的电流通过电流计时，由电流计指针在刻度盘上指示的位置，即可读出标准溶液和未知液的光密度（D）或百分透光度（T）。 2.分光光度计的结构分光光度计的种类和型号繁多，但它们都是由下列基本部件组成： 现将各部件的作用原理及性能讨论如下： （1）光源:常用的光源是钨丝灯，钨丝灯是常用于可见光区的连续光源（波长区域在320~2500nm）。氘灯是常用于紫外光区（180~375nm）的连续光源。 （2）单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置称为单色器，单色器由棱镜或光栅等色散元件，即狭缝和透镜等组成。 1）棱镜:光通过入射狭缝，经准直透镜成为平行光，然后以一定的角度射到棱镜上，在棱镜的两个界面上发生折射，而发生色散的光经会聚透镜被聚焦在一个微微弯曲并带有出射狭缝的表面上，移动棱镜或出射狭缝的位置，就可使所需波长的光通过狭缝射到试液上。 玻璃棱镜用于可见光区，石英棱镜可用于紫外光区、可见光区和近红外光区。 2）光栅:可采用透射光栅和反射光栅。前者是在一块玻璃或其他透明材料上刻一系列平行并紧紧相靠的凹槽；后者则是利用前者首先制取复制光栅，然后在其表面上喷涂铝的薄膜制成，也可在抛光的玻璃表面或金属表面镀铝，然后在铝表面上刻上大量的平行线制成，光栅的刻线越多，分辨率越高，每单位的刻线越多，色散就越大。 （3）样品池:样品池也称比色皿，按材料可分为玻璃和石英两大类。玻璃池只能用于可见光区，而石英池可用于紫外光区、可见光区和近红外光区。为了减少反射损失，使用时样品池的光学面必须完全垂直于光束方向。 样品池在使用之前应进行校正，校正方法如下:在样品池A和B内，分别装人试液和参比液，测量吸光度。要求标准使前后两次测定的吸光度差值不能大于10%（^10%）。在校正样品池时，应多选择几个波长测量吸光度，得到的校正值可供以后实验中使用。 （4）监测系统:监测器的功能是检测光信号，并将其转变为电信号。因此要求检测器对测定波长范围内的光有快速、灵敏的响应，*重要的是产生的光电流应与照射和其上的光强度成正比。分光光度计常用砸光电池或光电管作检测器，采用检流计作读数装置，两者组成监测系统。 3.光度测量的选择为了使光度分析法有较髙的灵敏度和准确度，除了要注意选择和控制适当的显色条件外，还必须注意选择适当的光度测量条件，主要应考虑以下几点： （1）人射光波长的选择:人射光波长应根据吸收曲线，选择溶液有*大吸收时的波长为宜，因为在此波长处，摩尔吸光系数B值*大，灵敏度较高，同时在此波长处的一较小范围内，吸光度的变化不大，不会造成对比尔定律的偏离。 如果*大吸收波长不在仪器可测波长范围内，或干扰物质在此波长处也有强烈的吸收，可选择非峰值处的波长。但应注意的是，尽可能选择其e值随波长变化不太大的区域内的波长。 （2）参比溶液的选择:光度测量时，常利用参比溶液来调节仪器的零点，以消除由于样品池及溶剂对人射光的干涉和吸收带来的误差。 在实际工作中，当试液、显色剂及所用的其他试剂在测定波长处无吸收时，可用纯溶剂（或蒸饱水）作参比溶液。如果显色剂无吸收，而待测试液有吸收，则应采用不加显色剂的待测试液作参比溶液。如果显色剂和试液均有吸收，可将一份试液加人适当的掩蔽剂，将待测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，然后按操作步骤加入显色剂及其他试剂，以此作为参比溶液。总之要求制备的参比溶液能尽量使待测溶液的吸光度真正反映待测物质的浓度。 （3）吸光度读数范围的选择:在不同吸光度读数范围内读数也可引入不同程度的误差，对测定产生影响，一般认为吸光度在0.2~0.8时，测量精度*好。根据朗伯-比尔定律，可以改变样品池厚度或试液浓度，使吸光度读数处在适宜的范围内。 4.双缩脲法测定蛋白质含量的原理在碱性溶液中，双缩脲（H2N—CO—NH—CO—NH2）与Cu2+作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含两个或两个以上酰胺基（—CO—NH2），或与此相似的基团[如一CH2—NH2CS—NH2C（NH）NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键（—C0—NH—），可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。 【材料、试剂与仪器】 （1）材料:血清，100ulTiP头，试管。 （2）试剂:双缩脲试剂，蛋白标准液，6mol/LNaOH溶液。 （3）仪器:水浴箱，可见光分光光度计，100ul微量移液器，5ml刻度吸量管。 【步骤与方法】 1.微量移液器的使用与校正微量移液器主要用于多次重复的快速定量移液，可单手操作，十分方便。 （1）微量移液器的分类:取液器可分为两种:一种是固定容量的，常用的有10u1、20u1、50ul、100uJ、200ul、500ul、1000ul等多种规格；另一种是可调容量的取液器，常用的有0.5~l0ul、10~40ul、20~200ul、100~500u1、200~1000ul等不同规格。 微量移液器下段为可装卸可更换的吸头，用微量移液器上方的“推进按钮”定量采取液体。每种取液器都有其专用的聚丙烯塑料吸头，吸头通常是一次性使用，当然也可以超声清洗后重复使用，而且此种吸头还可以进行120℃高压灭菌。 （2）微量移液器的使用：首先，选择一支量程合适的微量移液器，设定容量值，有些微量移液器通过旋转按钮设置容量，有些则通过刻度显示。若由低值旋转至高值，则需先超越设定值至少三分之一后再反转至设定值；若由髙至低，则直接旋转至设定值即可。 选择合适的吸头装在微量移液器套筒上，稍加扭转压紧，使吸头套紧。否则，移取的液体将少于设定的体积或者液体会往下滴。当装上一个新吸头时（或改变吸取的容量值）应预洗吸头，先轻轻吸打几次液样，可消除产生吸液误差。 吸液时，四指并拢握住微量移液器上部，用拇指按住柱塞杆顶端的按钮至**停点（图1-1-1），将微量移液器垂直浸入液面2~3mm，然后缓慢平稳地松开拇指，慢慢吸入液体。停留l~2s（黏性大的溶液可加长停留时间），然后将吸头提离液面。用吸水纸抹去吸嘴外面可能黏附的液滴。小心勿触及吸头口。 放液时，将吸头口贴到容器内壁并保持10°~40°倾斜，平稳地把按钮压到**停点，停l~2s（黏性大的溶液加长停留时间），继续按压到第二停点，排出残余液体。松开按钮，同时提起微量移液器。按吸头弹射器除去吸头（改用不同样本液体时必须更换吸头）。 图1-1-1可调式移液器的结构及持移液器的姿势 （3）微量移液器的校正:每年至少应检验校正2~3次，常用的方法有高铁氰化钾法、双蒸水称重法、水银称重法等。以水称量法为例:校正时要求室温20T，按正规操作吸取蒸馏水，并称其蒸镏水重量，同样记下蒸馏水重量及水温。计算出容积及校正值，如果相对百分误差大于±2%时，应进行调整。调整后，必须再进检测，直至微量移液器能正确给出调整的容积。 （4）注意事项 1）吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防将溶液吸入过快而冲入取液器内腐蚀柱塞而造成漏气。 2）加样时，微量移液器吸头只能以垂直方式浸入2~3mm，因为倾斜的方式将减少液体柱的高度，导致吸取液体过多。为确保样本的稳定释放，微量移液器吸头应靠在试管壁上，液体顺着管壁流出，避免出现液滴，液滴的形成可由于其表面张力的作用而阻止样本的释放。 3）当微量移液器中有溶液时，不得倒放，必须垂直放置，否则久后失准。 4）发现吸液时有气泡，将液体排回原容器；检查吸头浸入液体是否太深；换个吸头重新吸取样本。 2. 721型分光光度计的使用光谱范围在360~800nm，所有部件均在一主机内，操作方便，灵敏度髙。 （1）原理:以12V25W白灼钨灯为光源，经透镜聚光后射入单色光器内，经棱镜色散反射到准直镜，穿狭缝得到，波长范围更窄的光波作为人射光进入比色皿，透出的光波被受光器光电管所接受，产生光电流，再经放大在微安表上反映出电流大小，并直接读出光密度。 （2）使用方法 1）灵敏度选择钮放在“1”（如调不到“0”的选用较高档）。 2）转动波长旋钮，选用所需波长。 3）接通电源，打开电源开关，将仪器预热。 4）打开样品池盖（光门挡板自动遮住光路），转动零点调节旋钮，使电流指针恢复到透光度“0”。 5）将比色皿放人杯架中，使空白液对向光路，盖好样品池盖，转动“100%”，调准电表指针使之指向透光度100%位置上。 6）将标准液及测定液的比色杯依次推人光路，即可自电流计直接读出其光密度值。使用完毕后，将开关放回“关”的位置，切断电源，并将比色ML取出，用蒸馏水充分洗干净。 （3）注意事项 1）分光光度计属精密仪器，应精心爱护使用。防震、防潮、防腐蚀。 2）要保持比色皿的清洁干净，保护光学面的透明度。 3）读取光密度值的时间应尽量缩短，以防光电系统疲劳，如连续使用时，中间应适当使之避光休息。 4）比色皿不要放置在仪器面上，以免液体腐蚀仪器表面。 5）调“0”位及“100%”旋钮要轻旋，旋到终点时指针仍未指到位，一定不能再用力旋，以免损坏电位器。 3.双缩脲法测定蛋白质含量取试管3支，标明测定、标准和空白，然后按下表操作。 混匀，37℃水浴l0min，冷却至室温，在分光光度计波长540mn处，用空白管调零，比色测定，读取标准管，测定管的光密度值。 【结果分析】 【注意事项】 （1）双缩脲试剂要封闭贮存，防止吸收空气中的二氧化碳。 （2）本法各种蛋白质的显色程度基本相同，重复性好，几乎不受温度影响，**缺点是灵敏度较低。 （3）