医学免疫学实验指导

实验一抗原抗体的制备 能刺激机体免疫系统使之发生特异性免疫应答，并能与相应的免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外发生特异性结合的物质称为抗原（antigen，Ag）。完全抗原（如大多数蛋白质、细菌、病毒等）具有免疫原性和抗原性；半抗原（不完全抗原）单独存在，只具有抗原性，而不具有免疫原性。大多数多糖、脂类和某些药物等属于半抗原。 在一定量抗原的刺激下，机体能产生特异性免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig），即特异性抗体。抗体是免疫学实验中常用的材料，已知的诊断血清（抗体）常用于对抗原进行分析鉴定和定量检测。目前人工制备的抗体有多克隆抗体、单克隆抗体（单抗）和基因工程抗体。 一、抗原的制备 大多数蛋白质、细菌和病毒等病原微生物属于完全抗原。按物理性状不同又分为颗粒性抗原和可溶性抗原。 （一）细菌性抗原的制备（以伤寒杆菌H抗原和O抗原的制备为例） 【原理】 伤寒杆菌H901菌株纯培养物经0.4%甲醛生理盐水于37T水浴处理一定时间，可保留其鞭毛蛋白；若加热或用乙醇处理，则可破坏鞭毛蛋白抗原，但其菌体（O）抗原脂多糖性质不受影响。 【材料】 1.菌株伤寒杆菌H901菌株。 2.培养基普通琼脂（克氏瓶）培养基、普通琼脂平板、普通琼脂斜面培养基、肉汤培养基。 3.无菌生理盐水、0.4%甲醛生理盐水、无水乙醇。 4.371水浴箱、恒温培养箱。 5.无菌三角瓶、试管、刻度吸管、接种环、酒精灯等。 6.布朗标准比浊管。 【方法】 1.接种经鉴定的伤寒杆菌H901菌株至普通琼脂平板内，37T培养16～24h，挑取单个菌落转种至普通琼脂斜面培养基，37T培养18～24h。 2.加5ml无菌肉汤培养基至接种有细菌的普通琼脂斜面培养基上，静置5～10min，搓动试管，制成细菌悬液。 3.将细菌悬液接种于克氏瓶培养基内，尽量铺平于培养基表面，37T培养16～24h。 4.用适量无菌0.4%甲醛生理盐水冲洗刮取菌苔，移人无菌三角瓶内，置37T水浴24h。 5.取少许经0.4%甲醛生理盐水处理的菌液接种于肉汤培养基作无菌试验，无菌生长者用无菌生理盐水稀释至6亿～9亿菌/ml（用布朗标准比浊管测定），即获得伤寒杆菌H抗原，41保存备用。 6.用适量生理盐水冲洗刮下克氏瓶培养物，移人无菌三角瓶，加等体积的无水乙醇于其中，置37T恒温培养箱过夜。取少许接种肉汤培养基作无菌试验。无菌生长者即伤寒杆菌O抗原菌液。41保存，临用前，用生理盐水将其稀释至9亿菌/ml。 【注意事项】 本实验每个步骤都必须严格执行无菌操作，防止造成实验人员感染或引起实验室污染。 （二）红细胞抗原的制备（以绵羊红细胞悬液的制备为例） 【原理】 绵羊红细胞（SRBC）对家兔、小鼠等动物属于异种抗原。采集绵羊静脉血，抗凝，洗涤3次，除去血桨、白细胞和血小板等，即可获得红细胞。用生理盐水稀释，制成一定浓度的SRBC悬液。 【材料】 1.健康绵羊。 2.采血器材，如无菌注射器、兽用针头、剪刀、止血带、酒精灯、无菌棉球、2.5%碘酒、酒精等。 3.无菌三角瓶（内盛阿氏液）、无菌离心管和吸管、橡胶吸头、红细胞计数器等。 4.无菌生理盐水、水平离心机。 【方法】 1.用绳子交叉捆住绵羊四肢，使其侧卧于地，剪去颈部部分毛，用止血带扎住颈部，确定颈内静脉。 2.用2.5%碘酒和酒精消毒绵羊皮肤及采血者手指，持无菌注射器与颈内静脉呈30。角，从头部向躯干方向进针，缓慢抽动针芯，观察是否进人颈内静脉。 3.一旦抽出血液，即固定注射器，抽取30～50ml血液，迅速注人含阿氏液的无菌三角瓶内，立即混勻，41保存，备用。 4.取适量脱纤维羊血于离心管内，2000r/min5min，吸弃上清液及红细胞沉积物表面的白膜，加适量无菌生理盐水，毛细吸管吹吸几次以混勻，再离心弃上清，重复3次。 5.*后一次离心2000r/min10min，根据血细胞比容，用无菌生理盐水配成10%SRBC悬液。 6.取少许10%SRBC悬液再稀释200倍，用红细胞计数板计数后，配成2.0X108个细胞/ml。 （三）可溶性抗原的制备（以人血清抗原制备为例） 【原理】 人血清中含有多种蛋白质，根据电泳迁移率的不同，至少含有白蛋白及叫、％、P、Y球蛋白等成分。将多个个体的血清混合，则其所含的蛋白质更为复杂。人血清可作为可溶性抗原免疫家兔，制备兔抗人全血清抗体。 【材料】 1.志愿者血清。至少10人份血清混合，原则上份数越多越好。 2.药用天平、离心机、37T恒温培养箱。 3.无菌毛细吸管、无菌三角瓶、橡胶吸头、塑料小管等。 【方法】 1.采集的志愿者血液分别在室温中凝固后，置于37T恒温培养箱30mm，待血清析出。 2.将有凝固血的试管称重平衡，离心2000r/min10min。用无菌毛细吸管吸出血清，集中于无菌三角瓶中，轻摇混勻。 3.将混合血清适量分装于无菌塑料小管内，–20℃冻存备用。 【注意事项】 上述各步骤均应无菌操作，以免人血清被污染。 二、抗体的制备 （一）多克隆抗体的制备 将上述制备的抗原经不同途径注人免疫动物体内，其体内的B细胞能分化成桨细胞，产生特异性抗体。由于抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种抗原决定簇可激活具有相应抗原识别受体的B细胞产生与之相应的抗体。因此，天然抗原诱导动物产生的抗体是针对多种抗原决定簇的抗体混合物，称为多克隆抗体（polyclonal antibody）。 I.伤寒诊断血清的制备 【原理】 将制备好的伤寒杆菌H抗原和0抗原分别免疫健康家兔，多次注射后，家兔体内发生再次免疫应答，可产生高效价的抗H抗体和抗0抗体，这些抗体主要存在于免疫兔血清中。 【材料】 1.健康家兔（体重为2～2.5kg）。 2.伤寒杆菌H抗原和O抗原（临用前用无菌生理盐水洗涤3次，再用生理盐水将伤寒杆菌稀释成9亿个/ml）。 3.无菌注射器、5号针头、2.5%碘酒、酒精、无菌棉签、酒精灯、三角瓶、试管、水平离心机、37T恒温培养箱等。 4.无菌生理盐水、硫柳汞。 【方法】 1.将家兔分为2组，做好标记。免疫前分别从家兔耳缘静脉抽血，分离血清。将血清作系列倍比稀释后与伤寒杆菌H抗原和O抗原分别作试管凝集反应（见实验二“凝集反应”），检测家兔血清内是否含有抗伤寒杆菌H抗原和O抗原的天然抗体，选用不含天然抗体的家兔进行免疫。 2.兔耳缘背部经酒精消毒后，从耳缘静脉进行免疫注射，分H抗原和O抗原两组，如表1-1所示。 3.末次注射后7～10天试血。从耳缘静脉抽血1～2ml，分离血清，与相应抗原作试管凝集反应（见实验二“凝集反应”）。若凝集效价达1：1280以上，即可放血。若效价偏低，再用相应抗原3m咖强注射1～2次，可使特异性抗体效价明显升高。 4.收集抗血清。将试血合格的免疫家兔经心脏采血，收集血液于干燥三角瓶内，斜置于室温待其凝血，并置于371恒温培养箱中30min，使血清析出。收集血清于离心管中，2000r/min10min，收集血清。 5.将收集的血清混勻后，再测定效价，作适量分装，做好标记，-201冻存备用；也可加人硫柳汞（终浓度为0.01%）防腐备用。 【注意事项】 从耳缘静脉抽血前，*好先用二甲苯涂擦耳缘背部，使其充血便于进针。助手必须捏住兔耳根直至抽血完毕。 Ⅱ.溶血素的制备 【原理】 用绵羊红细胞（SRBC）悬液免疫家兔，家兔可针对SRBC产生特异性的体液免疫应答，合成和分泌大量抗SRBC抗体，抗SRBC抗体主要存在于被免疫家兔的血清中。在试管内抗SRBC抗体与SRBC可发生结合，加人补体后，在一定条件下，会导致SRBC的溶解，故抗SRBC抗体又称为溶血素。 【材料】 1.健康家兔（体重2～2.5kg）。 2.抗原：SRBC悬液（2.0X108个红细胞/ml）。 3.其余材料同伤寒杆菌多克隆抗体的制备。 4.叠氮化钠（NaN3）。 【方法】 1.如表1-2所示程序从兔耳缘静脉进行免疫注射。 2.末次免疫后第7～10天试血。方法详见实验四，溶血效价达1：2000以上时，即可采血，分离血清。 3.适量分装，做好标记，-20T下冻存，亦可加叠氮化钠至终浓度为0.01%，于4T中保存备用。 Ⅲ.兔抗人血清的制备 【原理】 以人血清免疫家兔，可获得兔抗人血清抗体。为使人血清能诱导家兔产生高效价特异性抗体，需添加佐剂。本试验采用弗氏完全佐剂，可使抗原在体内缓慢释放，延长抗原在体内的停留时间，以获得较佳的免疫效果。 【材料】 1.健康家兔（体重2～2.5kg）。 2.混合人血清、灭活卡介苗，青霉素、链霉素。 3.弗氏完全佐剂：称取羊毛脂12g，加液体石蜡20ml，高压蒸汽灭菌后即成为弗氏不完全佐剂。在弗氏不完全佐剂内加人一定量的灭活卡介苗，成为弗氏完全佐剂。 4.无菌乳钵、滴管、注射器、9号针头、2.5%碘酒、酒精、无菌棉签等。 【方法】 1.在混合人血清中加人灭活卡介苗及青霉素、链霉素，混勻，此为水相（卡介苗按10mg/m咖人，青霉素、链霉素分别按250U/ml和250咫/m咖人）。 2.取与水相等体积的弗氏不完全佐剂置于无菌乳钵中，逐滴加人上述水相成分，朝一个方向研磨，每加1滴，都要研磨均勻后再加第2滴，直到乳钵内形成油包水的白色乳剂；将乳剂滴加于水中完全不散开时为合格。 3.用不带针头的注射器吸取乳剂抗原，接上针头后、尽量排除空气，用无菌大试管套住注射器，于41中保存。 4.如表1-3所示免疫程序进行免疫注射。 5.末次注射后7～10天试血。用免疫兔耳缘静脉血清为抗体，用生理盐水作不同倍数稀释；用12倍稀释的混合人血清为抗原。按照沉淀反应要求，作琼脂双向扩散试验，方法详见实验三，以测定抗体效价。效价达1：32以上，即可心脏采血，分离并收获抗血清。 6.做好标记，适量分装，–20℃；下冻存。 （二）单克隆抗体制备 【原理】 借助物理或化学手段，将2个或2个以上不同特性的细胞融合在一起，组成一个异型核（heterokaryotic）细胞，形成的细胞称为杂交细胞。如果2个细胞中有一个为瘤细胞，则融合的细胞称为杂交瘤细胞。杂交瘤细胞具有两亲本细胞的基因，并可表达亲本细胞特性。 由免疫B细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞株可产生单一特异性、纯度高的抗体。该融合细胞是经过反复克隆而挑选出来的，由该克隆细胞产生的抗体称为单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）。一种McAb在分子结构、氨基酸序列以及特异性等方面都是一致的。 利用杂交瘤技术制备McAb的基本原理：①淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一个淋巴细胞克隆只产生一种抗体；②细胞融合技术所产生的杂交瘤细胞可以保持亲代细胞双方的特性；③利用代谢缺陷补救机制筛选出杂交瘤细胞，并进行克隆化，然后大量培养增殖，制备所需的McAb。 【材料】 1.实验动物6～8周龄健康Balb/c鼠。 2.杂交瘤细胞SP2/0骨髓瘤细胞。