基因工程实验教程

**部分基因工程实验 **章组织细胞遗传物质的提取 实验一动物胸腺或脾脏有核细胞基因组DNA提取 一、相关知识链接 生物的基因组（genome）是指一套染色体中的完整DNA序列。二倍体生物由两套染色体组成，其中一套染色体的DNA序列就是一个基因组。基因组一词可以特指核基因组，亦可用来表示细胞质基因组，如粒线体基因组或叶绿体基因组等。 胸腺和脾脏是哺乳动物重要的免疫器官，胸腺主要是T细胞分化和成熟的场所，具有免疫调节和自身免疫耐受的建立和维持等功能。脾脏是T和B淋巴细胞的定居场所，同时也是免疫应答的发生场所，在胚胎期还有造血功能。T和B淋巴细胞均具有全套的基因组DNA，通过胸腺或脾脏有核细胞基因组DNA的提取，可以为研究相关哺乳动物的遗传物质提供物质基础。 二、实验原理 应用十二烷基硫酸钠（sodium　dodecyl　sulfate，SDS）在较高温度条件下裂解细胞，同时联合使用蛋白酶K，使组织或细胞中蛋白质（尤其是核酸酶）充分降解，使染色体离析，蛋白变性，并释放出核酸，然后采用盐溶的方法，加人高浓度的饱和NaCl溶液，*后采用等体积的异丙醇沉淀DNA，以达到释放和萃取高质量核酸的目的。 三、实验目的 掌握从动物组织中提取DNA的操作方法，制备高质量的基因组DNA，作为PCR扩增的模板或基因组分析。 四、实验材料和配方 （一）实验器材与设备 恒温水浴锅，高速台式离心机，漩涡振荡器，高压灭菌锅，电子天平，低温冰箱，手术剪，微量移液器（10000、1000），加样枪头（1000pl、100pl），1.5ml离心管。 （二）试剂与配方 1.DNA提取液10mmol/LTiis-HCl（pH8.0），2mmol/LEDTA（PH8.0），0.4mmol/LNaCl，1%SDS。 2.其他试剂蛋白酶K（20mg/ml），异丙醇，70%乙醇溶液，无水乙醇，6mol/LNaCl，溴化乙锭（EB）染色液。 五、实验方法和步骤 1.将用于抽提DNA的动物组织（胸腺或脾脏组织）约50mg放人1.5ml离心管中，用手术剪剪碎成匀浆。 2.加人500+1的DNA提取液和200蛋白酶K，充分混匀后，55～65T水浴2～3h。 3.加人375+1的6mo1/LNaCl溶液，在漩涡振荡器上振荡30see。 4.12000g条件下离心30min后，量取上清液，加人等体积异丙醇，-20℃静置40min。 5.12000g离心15min后，弃去上清液，70%乙醇洗涤沉淀1次，无水乙醇洗涤沉淀1次。 6.空气中自然干燥沉淀后，加20+1无菌水溶解DNA。 7.取5μ1进行电泳鉴定。 电泳操作步骤如下。 （1）倒胶：取出有机玻璃内槽及隔板，洗净、晾干。将有机玻璃内槽置于水平位置且在其一端和中间插人隔板（即只制半块胶），为防止漏胶，可用滴管吸取少量的凝胶封好隔板边沿，然后放好样品梳子，并使梳齿高于底板约1.0mm。 将已配制好的0.8%琼脂糖凝胶溶液，连同锥形瓶放进微波炉加热，直至琼脂糖完全熔化’待琼脂糖凝胶液冷却至60～70T，小心地倒在有机玻璃板内槽’控制好倒胶速度’使胶液缓慢地展开，直至在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层（胶厚约4mm），室温下静置30min左右，待凝胶完全凝固后（白色透明），取下有机玻璃板内槽两端的隔板，再将内槽放人电泳槽中，加人电极缓冲液，使液面高出胶面1～2mm。轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的样品孔。 （2）上样：取长约10cm的透明胶（或封口膜）贴在实验桌上，间隔2cm，用微量移液器依次点上1+1DNA上样缓冲液，然后量取3～5+1样品与其在透明胶上混匀，再小心吸取样品并将其加人到样品孔内。加样时应避免枪头戳破样品孔，同时也要避免碰坏样品槽周围的凝胶面。操作时可用右手持移液器，左手握住右手腕，左肘支撑桌面，防止点样时右手晃动。同时，在样品孔的一端点上DNA分子量标准物（DNAMarker）以便于比较待测样品分子量大小。 （3）电泳：加样完毕，盖上电泳槽盖，将靠近样品一端连接负极，另一端连接正极（注意电极方向，勿接反了），接通电源，调节电压100V开始电泳。当溴酚蓝指示剂移动到凝胶长度的4/5距离左右，可停止电泳。 （4）染色：将电泳后的凝胶板小心推至EB染色液中，室温下浸泡15min。 （5）观察：戴三层一次性手套，用专用铲子从凝胶染液中小心取出凝胶置于托盘上，在凝胶成像仪上将凝胶板推至成像仪内部的黑色玻璃板上，在波长大于254nm的紫外透射光下进行观察。DNA存在位置呈现亮带，电脑拍照，保存图谱。 六、结果分析与讨论 图1-1显示所提动物总DNA经琼脂糖凝胶电泳检测结果，所提取得到的DNA大片段大于20kl）（DNAMarker为λDNA/EcoRI￣HindⅢ酶切片段，即*大片段为21．2kb）。 **章组织细胞遗传物质的提取 七、注意事项 1.在基因组DNA提取之前，需将动物组织处理成匀浆。 2.在DNA提取过程中，染色体DNA会由于机械剪切力发生断裂，产生大小不同的片段，因此在细胞破裂后，应尽量在温和条件下操作。 3.提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，混匀试剂、吸取上清等操作时均应避免动作剧烈，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。 （李惠敏　刘红美　谭涛　张洁　冯乐平） 实验二哺乳动物组织mRNA提取 一、相关知识链接 1961年Jacob和Jacques　Monod提出了信使RNA假说，认为细胞内肯定存在一种特殊的RNA是直接从DNA上合成的，它们的序列与DNA上的基因序列互补，然后被运输到细胞质中为蛋白质合成提供模板。mRNA的假说很快得到了Brenner、Jacob和Meselson等科学家的同位素实验确认，从而解决了遗传信息传递的问题。 生物细胞中的RNA主要包括信使RNA（mRNA），转运RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA）以及各种特殊功能的小分子RNA等。mRNA是合成蛋白质的模板，tRNA是转运氨基酸的运载工具，rRNA则是蛋白质翻译场所核糖体的重要构成部件，mRNA的碱基序列，决定着蛋白质装配时氨基酸的序列，因此，研究RNA具有重要的生物学意义。 二、实验原理 绝大多数哺乳动物细胞的mRNA在其端均有一个poly（A）尾端，因此可以应用oligo（dT）纤维素亲和层析法从细胞总RNA中分离出mRNA。当总RNA流经oligo（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo（dT）纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗脱下来。经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃；可保存一年以上。 三、实验目的 掌握从哺乳动物组织提取mRNA的原理和方法，提取的mRNA可以用于RT-PCR以及Northern杂父分析。 四、实验材料和配方 （一）实验器材与设备 冷冻台式高速离心机，涡旋振荡机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外分光光度计，层析柱，研钵，微量移液器，离心管。 （二）试剂与配方 1.无RNA酶灭菌水用将高温烘烤的玻璃瓶（180T，2h）装蒸馏水，然后加人0.01%（体积比）的DEPC（ml/ml），处理过夜后高压灭菌。 2.75%乙醇用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装人高温烘烤过的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 3.1X层析柱加样缓冲液20mmol/LTris-HCl（pH7.6），0.5mol/LNaCl，1mmol/LEDTA（pH8.0），0.1%SDS。 4.洗脱缓冲液10mmol/LTris-HCl（pH7.6），1mmol/LEDTA（pH8.0），0.05%SDS。 5.其他试剂液氮，Trizol试剂盒，氯仿，异丙醇、3mol/LNaAc溶液（pH5.2）。 五、实验方法和步骤 （一）总RNA的提取（Trizol法） 1.将组织在液氮中磨成粉末后，将50～100mg组织加人1mlTrizol液研磨。 （注意：样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%）。 2.研磨液室温放置5min，然后以每1mlTrizol液加人0.2ml氯仿的比例加人氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15sec。 3.取上层水相于另一离心管中，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加人异丙醇，室温放置10min，12000g离心10min。 4.弃去上清液，按每mlTrizol液加人至少1ml75%乙醇溶液的比例加人75%乙醇溶液，涡旋混匀，4℃7500g离心5min。 5.小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5～10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55～60T水溶10min。RNA可进行mRNA分离，或储存于70%乙醇溶液并保存于-70℃。 （二）mRNA提取 1.用0.1mol/LNaOH悬浮0.5～1.0goligo（dT）纤维素。 2.将悬浮液装人灭菌的一次性层析柱中或装人填有经DEPC处理，并经高压灭菌的玻璃棉巴斯德吸管中，柱床体积为0.5～1.0m1，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。 3.用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的PH<8.0。 4.将提取的总RNA液于65T温育5min后，迅速冷却至室温，加人等体积2x柱层析缓冲液后上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进人柱床后，加人1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。 5.测定每一管的OD2W值，当洗脱液中OD为0时，加人2～3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。 6.于260nm测定OD值，合并含有RNA的洗脱组分。 7.加人1/10体积的3mo1/LNaAc溶液（PH5.2），应用2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀于-20℃放置30min。 8.4℃下12000g离心15min，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5min。 9.小心弃去上清液，沉淀空气干燥10min，或真空干燥10min。 10.用少量DEPC水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇溶液中并贮存于-70℃）。 mRNA在70%乙醇中-70T；可保存一年以上。纤维素柱用后可用0.3m1/LNaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加人0.02%叠氮钠（Na%）冰箱保存，可重复使用。每次用前用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。 六、结果分析与讨论 （略） 七、注意事项 1.模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率，在构建cDNA文库时，必须经纯化步骤制备mRNA模板。由于mRNA分子的结构特点，容易受RNA酶的降解，加之RNA酶极为稳定且广泛存在，因此在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是实验成败的关键。 2.所有组织中均存在RNA酶，试剂和容器等也均可能被污染，因此实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200T烘烤2h以上。 3.凡不能用高温烘烤的材料，如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DE