环境DNA生物监测理论与方法

第1章绪论 1.1生态环境变化与生物多样性危机 地球*独*的特征是生命的存在，生命*美妙的特征是它的多样性。据保守估计，地球上大约栖息着（500±300）万种植物、动物、原生生物、真菌等生物，其中，仅约170万种生物被人类所命名（Costello et al.，2013）。尽管淡水生态系统面积不到地球表面积的1%，其淡水量不到世界水资源的0.01%，但为超过10%的人类所认知生物提供了栖息环境（Altermatt et al.，2020）。特别是，地球上约40%的鱼类生活在淡水生态系统中。然而，相比于山林、陆地、海洋等其他生态系统，淡水生态系统的生物多样性丧失*为严重，已成为地球上退化*严重的生态系统（Vorosmarty et al.，2010;Cardinale，2011;Cardinale et al.，2012）。因此，对淡水生态系统的管理与保护将直接与维持高水平的生物多样性和避免物种的大灭绝息息相关，关乎生态环境的可持续发展，符合生态文明建设的发展理念。 生物多样性为人类提供产品和服务，也是社会可持续发展的物质基础（Cardinale et al.，2012）。然而，由于密集的人类活动和全球性环境变化，自然生态系统中的许多生物面临着很高的灭绝风险。通常认为，影响淡水生物多样性的因素主要分为5类：水污染、水文水量变化、栖息地破坏、过度开发和外来物种入侵（Dudgeon et al.，2006;Best，2018;Grill et al.，2019）。在全球尺度上发生的环境变化，如气候变暖、降水模式变化以及氮沉降等，也会在这些胁迫因素基础上产生一定的叠加效应。虽然世界上许多国家在生活、生产等点源水污染控制方面取得了很大进展，但对水体富营养化和新型有机污染物排放关注较少，而其正成为威胁水生生物多样性的主导因素。此外，人类修建的水库和水顼的流量调节对栖息在自然流态的水生物种非常不利，加上全球性气候变化引发的频繁性洪水和干旱事件造成的栖息地改变，进一步减少了种群迁移和基因交换等生态过程。*近研究发现，全球接近50%的河流受到不同程度的连通性减弱影响（Grill et al.，2019）。由人类活动引发的栖息地破碎化及水文水量的改变正成为世界河流管理*棘手的问题。 1.2生物监测的需求与现有技术瓶颈 当前全球淡水生态系统正面临生物多样性丧失的危机。首先，人类对全球生态系统的支配使物种灭绝的速度是人类出现之前的几十倍甚至上百倍，被称为“第六次物种大灭绝”（Ceballos et al.，2015）。2019年生物多样性和生态系统服务政府间科学政策平台（Intergovernmental Science-Policy Platform on Biodiversity and Ecosystem Services，IPBES） 发布的《全球生物多样性和生态系统服务全球评估报告》（后称《IPBES全球评估报告》）指出全球超过一百万种物种面临灭绝，其中，84%的淡水脊椎动物、超过40%的两栖类物种受到威胁（Diaz et al.，2018）。其次，由于农业、园艺和交通介导的物种入侵，物种杂交水平大幅度提高，物种形成速度大大加快。尽管生物史上的大规模灭绝通常伴随着物种分化率的增加，但相比于灭绝率，人们对当今人类世物种分化率的变化趋势认识不足（Jackson，2008）。*后，人类活动造成全球生物分布的均质化（Poff et al.，2007;Monchamp et al.，2018）。人类活动改变了原始的生态系统分布格局，导致局域生物多样性、水生态功能受损。 人类对地球的影响持续增加，因此亟须加大对生物多样性监测的规模和频率。贸易全球化和新技术的不断诞生，使人员和货物的流动速度加快，造成广泛、不可逆转的环境退化。生态系统监测和评估所面临的艰巨挑战要求对监测技术体系进行革新，实现对生态系统结构和功能更迅速、准确和及时的观测。由于我们的目标是在社会经济发展和生态系统可持续性之间达成平衡，世界范围内已经建立了在环境限制下实现工业可持续发展的监管框架。此类监管体系已被纳入各种国家和国际指令中，尤其是针对水生生态系统的指令，例如，《欧盟水框架指令》（Water Framework Directive，WFD，法规编号：2000/60/EC）、《欧盟海洋战略框架指令》（Marine Strategy Framework Directive，MSFD，法规编号：2008/56/EC）、美国环境保护局《清洁水法案》、《联合国海洋法公约》等。生态系统的生物要素监测是此类监测项目的重要组成部分，并作为生态系统“健康”或“完整性”的衡量标准。法规中实施的大多数监测策略依赖于生物指示原则，即特定物种丰度与一系列环境变量之间的显著相关性。 环境保护是我国的一项基本国策。生物多样性关系人类福祉，是人类赖以生存和发展的重要基础。一直以来，我国实行“污染防治与生态保护并重，生态保护与生态建设并举”的方针，把生态建设作为环保工作的重中之重，积极开展生物多样性的保护和持续利用行动，制定了一系列保护和持续利用生物多样性的政策、法律、法规、计划和措施。中国于20世纪90年代完成了《中国生物多样性保护行动计划》和《中国生物多样性国情研究报告》，确定了我国生物多样性保护的重点工作领域、工作计划和未来发展目标。针对不同的生态系统，我国还制定了《中国海洋生物多样性保护行动计划》《中国湿地保护行动计划》等。2015年国务院印发《水污染防治行动计划》（简称“水十条”），明确要求“制定实施重点流域水生生物多样性保护方案”。2018年，生态环境部、农业农村部、水利部三部门联合制定并印发《重点流域水生生物多样性保护方案》，把流域水生生物多样性保护放在突出位置。2021年，我国首次提出将生物多样性指标纳入我国生态质量综合评价指标体系。 传统的生物监测技术严重限制了生物评价在生态环境管理中所发挥的作用。基于形态学的监测方法费时费力、价格昂贵，且需要熟练的操作人员，特别是浮游植物、浮游底栖动物和底栖无脊椎动物的识别和计数。因此迫切需要简化已有的监测方法，降低成本，加快监测速度；同时需要保障监测的质量、稳定性和可比性。传统基于形态学的监测方法需要每次收集和鉴定数百至数千个样本，这是一个缓慢、劳动密集的过程。这严重限制了生物监测的通量和物种的覆盖范围，无法满足日益增长的环境监测项目需求（Deiner et al.，2017;Taberlet et al.，2018）。传统方法的局限性还包括：①它只关注形态学上可识别的生物多样性，忽略了具有重要功能和指示意义的小型动物和微生物类群；②未关注大量形态学相似但对干扰的耐受性不同的隐蔽种多样性；③部分类群的分类检索系统尚不完善，甚至不同来源的分类资料存在分歧，且严重依赖于鉴定人的专业知识和经验，导致物种鉴定的准确率低。总的来说，需要更快、更客观、更有力和成本效益更高的工具和策略来进行更有效的生态系统监测，进而提升生态评估的科学性和应用价值。 1.3环境基因组学的发展 物种遗传特征（扩增子测序，即宏条形码）和其代谢功能（宏基因组学和宏转录组学）等环境基因组学技术的发展，正在塑造生物多样性监测的新模式（Zhang，2019）。国际上一些跨学科团队和组织发起了大规模的环境基因组学项目，如国际生命条形码（Barcode of Life）、地球微生物组群项目（the Earth Microbiome Project）和塔拉海洋项目（the TARA Oceans Project），旨在利用环境基因组学在全球范围内收集生物多样性数据，以解决基本的生态问题。这些项目逐渐揭开了全球生物多样性的神秘面纱。 在不同时空尺度上精准调查生物多样性的潜力是环境基因组学在生物监测领域应用的主要优势。测序成本的大幅下降显著降低了基于环境基因组学的生物监测成本。这使得其在资源与环境领域中的常规应用成为可能。另外，随着实验室操作步骤和生物信息学分析流程的不断发展和优化，现在大规模样本采集、组学测试、统计分析和结果解释等所有步骤都可以在几天或几周内完成。目前也已开发形成便携自动化的原位环境核酸采样器。因此，经济高效、自动化的分子监测技术可实现跨时间和空间尺度的大规模生物调查和比对，被应用于广泛和持续的生态系统监测方案中。 环境基因组学在生物监测领域具有很大的应用潜力。已有的实践表明，基于基因组学的方法可以满足当前对水生生态系统生物监测计划的大部分要求（Deiner et al.，2017;Zhang，2019）。通过收集和分析环境介质中不同分类群（如鱼类、大型无脊椎动物、原生生物、细菌）的生物多样性数据，环境基因组学技术已经广泛应用于监测生态系统的变化。在生态系统监测巨大机遇的鼓舞下，欧洲多个跨学科的研究人员组织起来，建立了DNAqua-Net平台，旨在建立和发展基因组工具和新型的生态基因组指数，用于常规的生物多样性监测和评估，从而用于欧洲水体的生物监测。国际上其他大型合作项目还包括加拿大的STREAM项目、新西兰的380Lakes项目、法国的NGB项目和中国的国家“水体污染控制与治理科技重大专项”。 环境基因组学在常规生物监测中的应用将带来一个生态环境监测与评估范式的转变。尽管形态学鉴定的方法尚不能被完全替代，新技术的突破将克服现有形态分类学方法的局限性，以满足不断变化世界中日益迫切的监测需求。毫无疑问，基于环境基因组学的方法将为更具成本效益、更快、可重复和半自动化的生态系统监测框架铺平道路。 1.4环境DNA开辟生态毒理学研究新时代 新化学物质的加速生产及其在全球范围内的环境释放引起了对其长期危害效应和自然生态系统可持续性的关注。环境污染物（如内分泌干扰化学物质，EDCs）可对野生动物个体、种群和生物多样性产生不利影响，进而影响生态系统所提供的服务。同时，全球水生生态系统也受到来自非化学压力因素的胁迫，例如栖息地退化、流量改变、富营养化、入侵物种、新型病原体和气候变化等。生态毒理学的一个主要挑战是如何区分导致生态系统退化的化学和非化学压力因素。这主要是由于缺乏有效和高效的工具来评估化学污染物对野外动植物个体、种群、群落以及生态系统功能的影响（Zhang，2019）。 首先，对野生动植物监测的忽视一直被认为是当前生态毒理学研究的关键弱点。传统毒理学研究的重点是少数物种甚至是亚个体水平的响应，然后用于预测生态系统层面的反应。例如，为了保护当地的鱼类，各国鼓励使用当地的鱼类，如美国黑头呆鱼（Pimephalespromelas）、日本青鎌（Oryzias latipes）和中国稀有鲍鲫（Gobiocypris rarus），进行生态毒理学试验。鲜有研究通过监测野外鱼类群落的个体和种群来评估化学物质的影响。虽然加拿大和许多欧洲国家已经开始将硅藻和大型底栖无脊椎动物（包括节肢动物、环节动物和软体动物等）的野外监测纳入常规应用，但在许多国家，特别是在发展中国家，通过传统的基于形态学的方法监测野外水生生物群落仍然是昂贵和不切实际的。 其次，化学物质对生物多样性和群落结构的影响也是目前生态风险评估所缺失的关键信息。污染物暴露会导致生物多样性的减少和群落结构的变化，进而导致生态系统服务与功能的退化。在过去的半个世纪中，基于经验选择藻类（初级生产者）、甲壳类动物（初级消费者）和鱼类（初级或次级消费者）作为化学物质毒性试验的关键目标（受体），已成功应用于保护水生生物群落中。部分模式生物已广泛用于毒性测试、生态风险评估和环境标准推导的工作中。然而，这种简化方法忽视了本土生物多样性和物种间敏感性差异。此外，已有研究证明化学污染物存在“间接”影响机制，如物种间相互作用、物种入侵和行为干扰等，可能会改变化学物质对生态系统的有害结局。因此，如果没有充分考虑环境污染物对生态系统生物多样性和群落结构的影响，很难从区域尺度评估单个化学物质对