白桦BpGT14基因和启动子的克隆及功能分析

前言 1 绪论 1.1 糖基转移酶简介 1.2 糖基转移酶功能 1.2.1 植物防御反应 1.2.2 植物次生代谢产物修饰 1.2.3 植物次生细胞壁合成 1.2.4 植物激素平衡 1.3 糖基转移酶14研究进展 1.3.1 GT14／DUF266(GT14-like)蛋白的鉴定 1.3.2 GT14和GT14-like基因系统发育的关系 1.3.3 GT14和GT14-like基因的进化 1.3.4 GT14和GT14-like基因的表达模式分析 1.3.5 GT14蛋白质三维结构及亚细胞定位 1.4 植物启动子研究 1.4.1 启动子结构及功能 1.4.2 启动子克隆方法 1.4.3 启动子的应用 1.5 转录因了研究 1.5.1 转录因子简介 1.5.2 转录因子分类及功能 1.6 转录因子与启动了互作研究方法 1.6.1 酵母单杂交 1.6.2 免疫共沉淀 1.7 植物DNA甲基化的作用方式及功能 1.7.1 植物DNA甲基化的作用方式 1.7.2 植物DNA甲基化的功能 1.8 木本植物小同发育阶段DNA甲基化水平和模式的变化 1.8.1 DNA甲基化与木本植物的年龄 1.8.2 DNA甲基化与木本植物的花期、休眠和育性 1.9 木本植物离体繁殖过程中的DNA甲基化模式重建 1.9.1 组织培养植株与野生植株的DNA甲基化水平和模式差异 1.9.2 再生过程、体胚发生、继代培养及外植体状态与DNA甲基化 1.10 植物DNA甲基转移酶及与甲基化有关的蛋白质 1.10.1 METI家族 1.10.2 CMT家族 1.10.3 DRM家族 1.11 白桦的生物学特性 1.12 研究意义 2 白桦BpGT14基因及其启动子的克隆及生物信息学分析 2.1 实验材料 2.1.1 植物材料 2.1.2 菌株及载体 2.1.3 数据分析 2.2 实验方法 2.2.1 白桦BpGT14基因生物信息学分析 2.2.2 白桦茎段悬浮细胞非生物胁迫处理 2.2.3 转录表达定量分析 2.2.4 数据处理 2.2.5 白桦BpGT14启动子的克隆 2.2.6 启动子生物信息学分析 2.2.7 植物表达载体的构建 2.2.8 植物表达载体农杆菌的转化 2.2.9 BpGT14启动子在烟草中的表达活性 2.2.10 启动子在白桦细胞中的表达活性 2.3 结果与分析 2.3.1 白桦BpGT14基因的生物信息学分析 2.3.2 白桦BpGT14基因时空特异性表达分析 2.3.3 白桦茎段悬浮细胞BpGT14基因非生物胁迫下表达分析 2.3.4 白桦BpGT14基因启动子克隆 2.3.5 白桦BpGT14基因启动子序列元件分析 2.3.6 启动子pXGUS-P及pXGFP-P植物表达载体的构建及鉴定 2.3.7 植物表达载体转化农杆菌的鉴定 2.3.8 非生物胁迫下启动子在烟草中的表达活性 2.3.9 启动子在白桦细胞中的表达活性 2.4 讨论 2.5 本章小结 3 酵母单杂交筛选启动子区及MYBPLANT元件结合候选蛋白 3.1 实验材料 3.2 实验方法 3.2.1 启动子1156bp片段PCR扩增 3.2.2 诱饵载体pAbAi线性化及与启动子片段的连接 3.2.3 MYBPLANT元件的构建 3.2.4 酵母感受态的制备 3.2.5 重组诱饵载体pAbAi转化酵母感受态细胞 3.2.6 诱饵酵母的鉴定 3.2.7 报告基因在诱饵酵母中本底表达水平的测定 3.2.8 白桦文库cDNA的合成 3.2.9 酵母单杂交文库的构建及筛选 3.2.10 阳性克隆菌株的鉴定 3.2.11 阳性克隆cDNA插入片段的生物信息学分析 3.2.12 启动子候选互作蛋白BpARF2基因的非生物胁迫响应 3.3 结果与分析 3.3.1 重组诱饵载体的构建 3.3.2 重组诱饵质粒转化酵母感受态细胞 3.3.3 报告基因在诱饵酵母中本底表达水平的测定 3.3.4 白桦文库cDNA的合成 3.3.5 酵母单杂交文库的构建及筛选 3.3.6 阳性克隆cDNA插入片段的生物信息学分析 3.3.7 启动子互作候选蛋白BpARF2基因非生物胁迫响应 3.3.8 MYB-pAbAi重组诱饵载体的构建 3.3.9 MYBPLANT元件结合候选蛋白的筛选 3.4 讨论 3.5 本章小结 4 启动子MYBPLANT元件结合候选蛋白的鉴定 4.1 实验材料 4.2 实验方法 4.2.1 候选蛋白互作强弱初步鉴定 4.2.2 白桦BpGT14基因的克隆 4.2.3 白桦BpGT14基因生物信息学分析 4.2.4 候选蛋白互作强弱初步鉴定 4.2.5 三次重复元件pCXGus植物表达载体构建 4.2.6 三亲杂交及农杆菌的遗传转化 4.2.7 烟草中GUS基因表达水平鉴定 4.2.8 非生物胁迫下白桦BpGT14基因表达水平鉴定 4.3 结果与分析 4.3.1 候选蛋白互作强弱鉴定 4.3.2 白桦BpGT14基因的克隆 4.3.3 白桦BpGT14基因生物信息学分析 4.3.4 白桦BpGT14基因植物表达载体的构建 4.3.5 三次重复元件pCXGus植物表达载体构建 4.3.6 BpAL4蛋白及MYBPLANT元件共转化分析 4.4 讨论 4.5 本章小结 5 白桦BpGT14基因表达载体及RNA干扰载体的构建及遗传转化 5.1 实验材料 5.2 实验方法 5.2.1 白桦总RNA的提取与cDNA的合成 5.2.2 白桦BpGT14基因pMD18-T载体的构建 5.2.3 白桦BpGT14基因干扰载体的构建 5.2.4 三亲杂交法转化根癌农杆菌 5.2.5 根癌农杆菌介导的白桦遗传转化 5.2.6 转基因植株的分子鉴定 5.2.7 转基因白桦组培苗的移栽 5.2.8 石蜡切片 5.2.9 转基因白桦木质素、纤维素、半纤维素和果胶的测定 5.3 结果与分析 5.3.1 白桦BpGT14基因PMD18-T载体的构建 5.3.2 白桦BpGT14基因干扰载体的构建 5.3.3 三亲杂交 5.3.4 转基因植株的获得 5.3.5 转基因植株的分子鉴定 5.3.6 RNAi白桦茎段结构分析 5.3.7 BpGT14-RNAi转基因白桦细胞壁成分分析 5.4 讨论 5.5 本章小结 6 白桦微繁过程中BpGT14表达及DNA甲基化的变异机制 6.1 实验材料 6.1.1 植物材料 6.1.2 实验器材 6.2 实验方法 6.2.1 培养基及培养条件 6.2.2 外植体选取与消毒 6.2.3 腋芽增殖的继代培养 6.2.4 愈伤组织的诱导及分化 6.2.5 再生植株生根及移栽 6.2.6 酶液制取 6.2.7 保护酶活性的测定 6.2.8 木质素测定 6.2.9 丙二醛含量测定 6.2.10 可溶性糖含量测定 6.2.11 可溶性蛋白含量测定 6.2.12 白桦DNA提取及亚硫酸盐处理 6.2.13 BpGT14及甲基转移酶基因表达量分析 6.2.14 数据处理 6.3 结果与分析 6.3.1 愈伤组织织的诱导和分化 6.3.2 甲基转移酶基因的表达 6.3.3 甲基转移酶的活性分析 6.3.4 5-CCGG的胞嘧啶甲基化水平 6.3.5 再生不同阶段细胞氧化还原水平 6.3.6 再生不同阶段变异的主成分分析 6.3.7 愈伤再生不同发育阶段BpGT14基因表达分析 6.3.8 白桦BpGT14基因内含子生物信息学分析 6.3.9 愈伤再生不同发育阶段BpGT14基因启动子及编码区DNA甲基化变异 6.4 讨论 6.4.1 甲基转移酶基因在再生过程中的表达 6.4.2 白桦组织培养中DNA甲基化的变化 6.4.3 微繁殖过程中的生理变化 6.4.4 不同发育阶段的表观遗传参数和生理指标的变化 6.4.5 愈伤再生不同发育阶段BpGT14基因启动子及编码区DNA甲基化变异 6.5 本章小结 7 展望 参考文献