中国线虫学研究:第七卷:Vol.7

甘薯象耳豆根结线虫的初报 中国线虫学研究(第七卷),2018，7：6～11 Nematology Research in China,2018,Vol7：6～11 甘薯象耳豆根结线虫的初报基金项目：国家自然科学基金(31501616；31401721)；国家甘薯产业技术体系(CARS-10-B16)；河北省自然科学基金（C2015301043） 高波**作者：高波，助理研究员，从事植物寄生线虫学研究;Email：gaobo89@163com，马娟，王容燕，李秀花，陈书龙通信作者：陈书龙，研究员，从事植物寄生线虫学研究;Email：chenshulong65@163com （河北省农林科学院植物保护研究所，河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心， 农业部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室，保定071000） 摘要：甘薯寄生线虫病是甘薯生产上严重病害之一，特别是在我国长江中下游和南方薯区，根结线虫为害较重，本研究应用分子生物学手段对来自广东湛江和重庆甘薯上的根结线虫种类进行了鉴定。通过利用根结线虫属通用引物MF/MR，以及南方根结线虫特异引物MiF/MiR，爪哇根结线虫特异引物Fjav/Rjav和象耳豆根结线虫特异引物MeF/MeR初步鉴定结果表明两地的根结线虫均为象耳豆根结线虫，进一步对28S rRNA D2D3区域和rDNAIGS2区域进行Blast比对和系统发育分析，*终确定来自两地的发病薯块的病原线虫均为象耳豆根结线虫。 关键词：甘薯；象耳豆根结线虫；分子鉴定；特异引物 Preliminary Study on RootKnot Nematode Meloidogyne enterolobii in Sweet Potato in China Gao Bo，Ma Juan，Wang Rongyan，Li Xiuhua，Chen Shulong (Plant Protection Institute of Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences；IPM centre of Hebei Province；Key Laboratory of IPM on Crops in Northern Region of North China，Ministry of Agriculture；Baoding071000，China) Abstract：Parasitic nematode disease of sweet potato is one of the most serious diseases on sweet potato productionThe species of root knot nematodes in sweet potatoes from Zhanjiang，Guangdong and Chongqing were identified by molecular biological methodsBy using the root knot nematode universal primers MF/MR，Meloidogyne incognita specific primers MiF/MiR，Mjavanica specific primers Fjav/Rjav and Menterolobii specific primers MeF/MeR，the nematodes from both places were preliminary identified as MenterolobiiFurther based on Blast alignment and phylogenetic analysis of the 28 s rRNA D2D3 and rDNA  IGS2，the pathogenic nematodes of the diseased sweet potatos from these two places were finally confirmed as Menterolobii Key words：Sweet potato；Menterolobii；Molecular biological methods；Specific primers 甘薯（Ipomoea batatas Lam）在我国是继小麦、水稻、玉米、大豆之后的第五大粮食作物，种植面积和总产量分别占世界的70%和85%左右，常年种植面积在700万hm2左右，是世界上*主要的生产国［1］。但是甘薯病虫害的发生却严重地制约着我国甘薯的产量和品质。 甘薯寄生线虫病是甘薯上发生*严重的病害之一，目前在我国已报道的甘薯寄生线虫包括：马 铃 薯 腐 烂 茎 线 虫（Ditylenchus destructor)［2］、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、高弓根结线虫(Macrita)、花生根结线虫(Marenaria）［3］、矮化线虫（Tylenchorhynchus spp）、短体线虫(Pratylenchus spp)、肾形线虫(Rotylenchulus spp)、盘旋线虫(Rotylenchus spp)、螺旋线虫(Helicotylenchus spp)、盾状线虫(Scutellonema spp)、孢囊线虫(Heterodera spp)、针线虫(Paratylenchus spp)、半穿刺线虫(Tylenchulus spp)、滑刃线虫(Aphelenchoides spp)、剑线虫(Xiphinema spp)、矛线虫(Dorylaimus spp)［4］等。而未见有象耳豆根结线虫（Menterolobii）［5］田间侵染甘薯的报道，本研究从广东湛江和重庆的甘薯薯块中发现了根结线虫的侵染，后经分子水平的鉴定证明该根结线虫为象耳豆根结线虫，这是该线虫侵染我国甘薯的首次报道。 1材料和方法 11试验材料 从广东湛江和重庆采集的甘薯薯块，2×Es Taq MasterMix、Gel Extraction Kit、PurePlasmid Mini Kit均购自于康为世纪，T4 DNA Ligase、pMD18T购自于大连宝生物，感受态细胞DH5α、水浴锅、恒温摇床、超净台、恒温培养箱。 12试验方法 121卵囊的剥离与孵化 将受侵染薯块和薯根中的卵囊在显微镜下拨出，置于盛有灭菌水的培养皿中并于25℃孵化培养5～7d，即得到象耳豆根结线虫的二龄幼虫。 122线虫DNA的提取 线虫DNA的提取参考李君实等［6］的方法，向PCR反应管中加入14μL灭菌的双蒸水，然后挑入幼虫1头，用细针刺破搅碎，加入3μL 10×PCR bufer和3μL蛋白酶K（600μg/mL），使总体积为20μL；放入-20℃的冰箱低温处理10min以上，然后放入PCR仪中于65℃下温育15h，95℃下温育10min；取出12 000r/min离心1min，上清DNA于-20℃下保存。 123目的基因的扩增 首先利用根结线虫属的28S rRNA的D2D3区通用引物MF/MR（序列见表1）进行PCR扩增鉴定，再利用南方根结线虫特异引物MiF/MiR，爪哇根结线虫特异引物Fjav/Rjav以及象耳豆根结线虫特异引物MeF/MeR进行进一步的验证。 表1鉴定引物及其序列信息［7］ 引物名称引物序列 MFGGGGATGTTTGAGGCAGATTTG 通用引物 MRAACCGCTTCGGACTTCCACCAG MiFGTGAGGATTCAGCTCCCCAG 南方根结线虫 MiRACGAGGAACATACTTCTCCGTCC FjavGGTGCGCGATTGAACTGAGC 爪哇根结线虫 RjavCAGGCCCTTCAGTGGAACTATAC MeFAACTTTTGTGAAAGTGCCGCTG 象耳豆根结线虫 MeRTCAGTTCAGGCAGGATCAACC