哺乳动物细胞重组蛋白工程

**章　适合重组蛋白表达的哺乳动物细胞 1
　　**节　CHO细胞表达系统 3
　　　　一、CHO细胞历史与分类 3
　　　　二、CHO细胞表达系统的优点 10
　　　　三、CHO细胞培养 13
　　第二节　HEK293细胞表达系统 17
　　　　一、HEK293细胞的分类与优点 17
　　　　二、HEK293细胞培养与鉴定 19
　　第三节　其他哺乳动物细胞 21
　　　　一、人源化细胞系 21
　　　　二、非人源化细胞系 23
　　参考文献 24

第二章　基因工程 28
　　**节　基因工程简介 28
　　　　一、基因工程概念 28
　　　　二、基因工程的发展史 29
　　　　三、基因工程的应用和基因工程医药的前景 32
　　第二节　哺乳动物细胞基因工程 35
　　　　一、目的基因获取 36
　　　　二、载体系统 37
　　　　三、DNA的体外重组 45
　　　　四、重组DNA的转化 49
　　　　五、重组DNA的筛选与鉴定 49
　　　　六、目的基因的表达 50
　　参考文献 52

第三章　载体工程 55
　　**节　表达载体元件的优化 56
　　　　一、启动子 56
　　　　二、增强子 66
　　　　三、多聚腺苷酸尾 67
　　　　四、内含子 67
　　　　五、内部核糖体进入位点和F2A 68
　　　　六、选择标记 69
　　　　七、翻译与分泌优化 69
　　第二节　染色质调控元件 71
　　　　一、核基质附着区 72
　　　　二、遍在染色质开放元件 75
　　　　三、绝缘子 75
　　　　四、稳定抗阻遏元件 76
　　第三节　靶基因整合 77
　　　　一、位点特异性重组系统 77
　　　　二、基于核酸酶和DNA修复途径的位点特异性整合 79
　　第四节　非靶向转基因整合 80
　　　　一、转座子 80
　　　　二、慢病毒载体 80
　　参考文献 81

第四章　转染与筛选 87
　　**节　细胞转染 87
　　　　一、细胞转染的原理 87
　　　　二、细胞转染方法 88
　　第二节　细胞转染后的筛选 93
　　　　一、瞬时转染与稳定转染 93
　　　　二、稳定细胞系的筛选 94
　　　　三、CHO细胞加压筛选 99
　　　　四、HEK293细胞表达系统 102
　　参考文献 106

第五章　基因组编辑与细胞工程 108
　　**节　基因组编辑技术 109
　　　　一、概念 109
　　　　二、常用的基因组编辑技术 109
　　第二节　CRISPR/Cas9技术在哺乳动物细胞中的应用 117
　　　　一、基因的破坏 119
　　　　二、位点特异性基因整合 120
　　　　三、基因激活或抑制 120
　　　　四、基因组水平目的基因敲除的筛选 121
　　　　五、基因编辑应用实验设计 121
　　　　六、脱靶分析 124
　　第三节　CHO细胞工程 125
　　　　一、目的基因 126
　　　　二、细胞工程常用技术 131
　　　　三、抗凋亡工程 134
　　　　四、代谢工程调控 135
　　　　五、细胞骨架与细胞周期工程 136
　　　　六、蛋白质翻译后修饰工程 136
　　　　七、蛋白质合成工程 138
　　参考文献 139

第六章　动物细胞培养基及其优化 144
　　**节　细胞培养基 145
　　　　一、细胞培养基简介 145
　　　　二、动物细胞培养基的分类 146
　　　　三、细胞培养基的相关政策与标准 151
　　　　四、细胞培养基的主要成分 162
　　　　五、细胞培养基的理化性质 170
　　　　六、细胞培养基的灭菌及储存 171
　　　　七、细胞培养基的配制 173
　　第二节　CHO细胞培养基 177
　　　　一、CHO细胞培养基概况 177
　　　　二、CHO细胞无血清培养基的成分组成及优化 179
　　第三节　其他细胞系培养基 182
　　　　一、HEK293细胞系培养基 182
　　　　二、HeLa细胞系培养基 183
　　参考文献 184

第七章　培养工艺与大规模培养 188
　　**节　动物细胞大规模培养参数 189
　　　　一、温度 189
　　　　二、通气 189
　　　　三、pH 190
　　　　四、渗透压 190
　　　　五、搅拌 190
　　　　六、防止污染 190
　　第二节　动物细胞大规模培养 191
　　　　一、动物细胞大规模培养反应器 191
　　　　二、动物细胞大规模培养操作方式 194
　　参考文献 231

第八章　哺乳动物细胞重组蛋白的分离及纯化 234
　　**节　重组蛋白样品的预处理 234
　　　　一、透析法 235
　　　　二、超滤法 235
　　　　三、冷冻干燥法 236
　　　　四、双水相萃取法 236
　　第二节　重组蛋白分离纯化的原理及方法 237
　　　　一、蛋白质沉淀 237
　　　　二、亲和色谱 242
　　　　三、高效液相色谱 247
　　　　四、分子筛色谱 254
　　　　五、离子交换色谱 256
　　　　六、其他纯化技术 267
　　参考文献 269

第九章　重组蛋白分析与鉴定 271
　　**节　重组蛋白理化性质分析 272
　　　　一、重组蛋白的电荷异质性分析 272
　　　　二、重组蛋白分子量测定 275
　　　　三、重组蛋白的其他性质 277
　　第二节　重组蛋白定量分析技术 278
　　　　一、标准定量法 279
　　　　二、比色分析法 280
　　　　三、紫外吸收法 282
　　　　四、ELISA测定 282
　　　　五、蛋白质印迹法 283
　　第三节　空间结构分析 283
　　　　一、蛋白质的空间结构 284
　　　　二、X射线衍射晶体分析 285
　　　　三、核磁共振 287
　　　　四、生物质谱技术 290
　　参考文献 292

第十章　重组蛋白糖基化修饰与控制 295
　　**节　糖基化修饰类型及其作用 295
　　　　一、糖基化及其修饰类型 295
　　　　二、糖基化修饰的生物学作用 297
　　第二节　重组蛋白糖基化工程及其应用 299
　　　　一、重组蛋白糖基化工程 299
　　　　二、重组蛋白糖基化修饰改造策略 299
　　　　三、重组蛋白糖基化工程的应用 301
　　第三节　重组蛋白糖基化控制 302
　　　　一、基因组学水平 302
　　　　二、系统生物学水平 305
　　　　三、质量控制与评价 306
　　参考文献 308

第十一章　重组抗体质量控制 311
　　**节　重组抗体生产细胞的质量控制 312
　　　　一、建构工程细胞和细胞库 312
　　　　二、细胞质控 313
　　第二节　重组抗体的质控标准物质 313
　　　　一、理化对照品的结构验证 313
　　　　二、活性标准品的协作标定 314
　　第三节　重组抗体生产产品的质量控制 315
　　　　一、产品质量一致性分析 315
　　　　二、生物学活性测定 317
　　　　三、蛋白质含量及纯度测定 318
　　　　四、残留杂质分析 319
　　　　五、安全性和其他检测项目 319
　　第四节　重组抗体生产实例——质量属性评价 319
　　　　一、还原型毛细管凝胶电泳测定重组抗体的纯度及杂质 319
　　　　二、分子排阻高效液相色谱测定重组抗体的纯度及杂质 319
　　　　三、分子排阻色谱分离静态光散射测定聚体的分子量 320
　　　　四、成像毛细管等电聚焦电泳检测电荷异质性 320
　　　　五、圆二色谱分析抗体分子的结构 320
　　参考文献 321

第十二章　重组蛋白药物的研究开发与管理 322
　　**节　重组蛋白药物研究开发的一般过程 322
　　　　一、上游研究 323
　　　　二、中试研究 324
　　　　三、临床前研究 326
　　　　四、临床研究 328
　　　　五、新药临床研究与生产的申报和审批 330
　　第二节　重组蛋白药物研究开发的相关法规 333
　　　　一、重组蛋白技术产品研究开发相关法规的主要内容 333
　　　　二、研发各个环节的质量管理规范 337
　　第三节　重组蛋白技术产品的生物安全问题 339
　　　　一、重组蛋白技术产品及其产品生物安全问题的范围 340
　　　　二、重组蛋白技术产品及其产品生物安全问题的预防和控制 341
　　　　三、生物安全性评价 342
　　参考文献 344

附录　中英文词汇表 347