粪菌移植临床应用

第1章　肠道菌群概述 **节　人体肠道菌群基本概念 肠道微生物有非细胞型微生物、原核微生物、真核微生物三类。非细胞型微生物寄生于细胞内，无典型细胞结构，仅有DNA或RNA（如病毒）；原核微生物核质无核膜和核仁，细胞器只有核糖体，包括细菌、放线菌、立克次氏体、衣原体、支原体、蓝细菌和古细菌等；真核微生物细胞核和细胞器完整，有真菌、假菌、黏菌、原生动物和微型藻类等。细菌占肠道微生物的99%，故习惯称“肠道微生物群”为“肠道菌群”。肠道细菌有表型分类、分析分类和基因型分类（16S rRNA同源分析）3种分类方法，实际应用中多采用基因型分类，70%以上DNA同源（种），特性相近、关系密切的菌种组成菌属。原核微生物分为两个域，即古生菌域和细菌域，前者分2个门，后者分24个门，向下依次分为纲、目、科、属、种。例如，大肠杆菌属于原核生物界、细菌域、变形菌门、变形菌纲、肠杆菌目、肠杆菌科、埃希菌属中的一个种。 根据可培养细菌数量，肠道菌群分为主要（优势）菌群（predominant microflora）和次要菌群（sub-dominant microflora）：①主要菌群指肠道菌群中数量大或种群密集度大的细菌，数量一般在1010CFU/g以上，包括类杆菌属、优杆菌属、双歧杆菌属、瘤胃球菌属和梭菌属等专性厌氧菌，通常属于原籍菌群，是宿主发挥生理功能的菌群；②次要菌群数量在1010CFU/g以下，主要为需氧菌或兼性厌氧菌，如大肠杆菌和链球菌等，其流动性大，有潜在致病性，大部分属于外籍菌群或过路菌群。乳杆菌在数量上归为次要菌群，在回肠中含量较高，但其具有较为重要的功能，在功能上归属优势菌群。 优势菌群与组织环境特征密切相关，以厌氧菌为主的优势菌群，一般生存在清除速率较低、营养丰富的环境中（如结肠）；而兼性或需氧菌一般生活在清除速率高的小肠近端。另外，在酸性环境中，耐酸、产酸的细菌为优势菌群。组织环境的改变，可使菌群中的优势菌群发生替换，如便秘时大便优势菌群主要是革兰氏阴性厌氧菌，慢性腹泻时常见革兰氏阳性杆菌为优势菌群，而在严重急性腹泻时大便中的优势菌群为致病性细菌或某些兼性/需氧细菌。在肠道中，尽管专性厌氧菌是主要菌群，占据优势，但这些菌群又依赖于需氧菌或兼性厌氧菌等次要菌群的存在，因为后者在增殖过程中消耗氧气，保证前者的生长条件。一个生理性组合的肠道菌群是有益的，而病理性组合的肠道菌群是有害的，宿主的健康需要保持合理的肠道微生物菌群分布丰度。 第二节　人体肠道菌群的组成和分布 人体肠道细菌数约为*，是人体细胞数量的10倍，其基因总数是人类基因总数的150倍，可以分为三大类：有益菌、有害菌和中性菌。有益菌主要是双歧杆菌、乳酸杆菌等，它们是人体健康不可缺少的要素，可以合成各种维生素，参与食物的消化，促进肠道蠕动，抑制致病菌群的生长，分解有害有毒物质等；有害菌一旦失控，大量生长，就会引发多种疾病，产生致癌物等有害物质，或者影响免疫系统的功能；中性菌是具有双重作用的细菌，如大肠杆菌、肠球菌等，在正常情况下对健康有益，一旦增殖失控或从肠道转移到身体其他部位，可引发许多问题。肠道菌群在长期的进化过程中，通过个体适应和自然选择，菌群之间，菌群与宿主之间，菌群、宿主与环境之间，始终处于动态平衡状态中，形成一个互相依存，相互制约的系统。因此，人体在正常情况下，菌群结构相对稳定，对宿主表现为不致病。有研究指出，体魄强健的人肠道内有益菌的比例可达70%，普通人则是25%，便秘人群可减少到15%，而癌症患者肠道内益生菌的比例只有10%。 一、肠道菌群的建立与变迁 肠道内菌群的建立始于出生的那一刻，婴儿出生前处于无菌状态，在通过母亲阴道时接触了**批细菌，出生后随着呼吸与进食，肠道开始不断积累各种细菌。在母乳喂养的婴儿中，双歧杆菌（主要有两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌）占粪便菌群量的80%～90%，比人工喂养的婴儿粪便中的双歧杆菌数量要高。这可能是因为人工配方奶粉容易使肠道处于弱碱性，不利于双歧杆菌的生长。3岁以前，以双歧杆菌为*的益生菌是肠道的绝对优势菌，其他细菌只占1%，婴儿断奶前的大便很干净，无异味，断奶后，吃饭逐渐和成人接近，大便变臭，肠内菌群发生改变，双歧杆菌的比例下降到10%左右，拟杆菌等中立菌增多，此时有益菌依然占据优势。这时肠道内细菌的生态平衡格局就基本稳定下来，数量*多的是拟杆菌、真杆菌、消化球菌，其次是双歧杆菌，再次是大肠杆菌、链球菌、乳酸杆菌、梭状芽孢杆菌和葡萄球菌。这种格局贯穿健康人的整个成年期（图1-1）。断奶婴儿、儿童和成人粪便中菌群组成相似，但50岁以后，双歧杆菌等有益菌却趋于下降，产气荚膜杆菌等有害菌的数量上升，肠道菌群的组成会发生显著变化，因此，老年人就经常出现便秘、大便异味等症状了。 图1-1　人体肠道菌群分布和主要菌群 二、肠道菌群的特征 （一）主要特征 健康肠道菌群有4个主要特征：多样性、稳定性、弹性和差异性。 正常人肠道菌群有75000余种，能培养的有500～1000种，每个人均有自己独特的肠道菌群，这是肠道菌群的多样性。 大多数人的肠道菌群差异是相似的（“Substantial core”模型）。描述人与人之间肠道菌群的差异，有4种模型：①不同人群共用极少数的核心肠道菌群模型（“Minimalcore”模型）；②个体肠道菌群差异极大模型（“No core”模型）；③肠道菌群构成在不同人群中是渐变的模型（“Gradient”模型）；④不同亚群之间存在共同的肠道菌群，但是又不交叉的模型（“Subpopulation”模型）。 另外，一个健康个体的肠道菌群在受到刺激后能够迅速、完全恢复到基线水平是人类肠道菌群的另一个主要特征，即肠道菌群的稳定性和自我恢复能力。宿主微生物群共生的稳定性是评估恢复力的另一个重要指标。 （二）动态平衡 尽管组成正常菌群的种类相当稳定，但构成这些菌群的菌株经常发生变化。当肠道菌群处于健康的平衡状态时（大肠内的益生菌是有害菌的1000倍到1万倍），致病菌或者条件致病菌以很少的数目存在，它们产生的有毒代谢物不足以对宿主的健康产生危害。但机体急剧变化时，肠道菌群平衡被打破时，人体就会出现腹泻、便秘、消化不良等症状，导致健康受损。影响肠道菌群的因素有：人体自身的因素（肠道的酸碱性、胆汁及消化酶的分泌、肠道的蠕动、肠道黏液的分泌、肠道表皮的脱离）及所处的环境因素（压力、出差），人体摄入的饮食（可消化的食物与不可消化的纤维、药物），细菌自身的因素（黏附能力、繁殖能力、营养需求量、抗消化酶能力）和细菌之间的相互作用（营养竞争、相互抑制作用、协同作用）。 （三）肠道菌群群体分型 1.肠型　肠型被描述为“在群落组成的多维尺度空间中样本密集的集群”，并且不会受年龄、性别、文化背景和地理位置的影响。将不同的肠道微生物群落组成和结构定义为不同的肠型，可用于指导临床实践。美国人类微生物组计划（HMP）、欧洲人类肠道宏基因组计划（Meta HIT）和众多其他的肠道菌群研究都证明个体间微生物群落存在差异，另外，肠道微生物群落的变化还表现出不同的演替阶段，可分为婴幼儿快速变化期、成人稳定期和老年退化期。这些特征是肠道菌群群体分型的生物学基础（图1-2）。其中，对肠型分类起主要贡献的3种肠道微生物——普氏菌、拟杆菌和瘤胃球菌是肠道菌群的核心物种。 2011年，采用3种测序技术（Illumina、454和Sanger）对来自3个国家（丹麦、西班牙和美国）的人类粪便样本中的16SrRNA基因进行测序分析，在属水平得出肠道微生物存在3种肠型，每一种肠型存在一种指示/驱动类群，即这一类微生物与给定的肠型*相关：肠型1（ET-B），拟杆菌（Bacteroides）是其*好的指示类群；肠型2（ETP），是由普氏菌（Prevotella）驱动的，它的丰度通常与拟杆菌的丰度成反比；肠型3（ET-F），是通过厚壁菌（Firmicutes）占比高低来区分的，其中*主要的类群为瘤胃球菌（Ruminococcus）。但有一些属表现出功能异质性，如链球菌（Streptococci），它既包含常见的共生菌和致死性病原体，又包含可以用于食物发酵的类群，因此，不应该忽略群落在物种水平和菌株水平的变异。尽管这一人为的定义存在局限性，由此产生的群落聚类只能部分反映群落间距离的复杂结构，但肠型的概念已经证明对分析微生物组数据非常有帮助。一项关于美国人饮食的大数据分析结果支持两种肠型的结论，一种类型包含与ET-P类似的优势类群，另一种为ET-B和ET-F类型的混合型；另外，还发现婴儿具有与成人完全不同的肠道菌群，主要含有双歧杆菌（Bifidobacteria）和变形菌（Proteobacteria）。 图1-2　健康人体不同分类方法下微生物在属水平的差异 基于2381个16S测序样本，展示了不同部位菌群的差异程度：A.基于OTU 水平的非权重距离；B.属水平的Jensen-Shannon 距离；C.OTU水平的Jensen-Shannon距离 肠型间的功能差异支持了不同群体特征的概念，如丰富度、多样性和时间稳定性。从生态学角度来看，这些特征都是相关的，理论预测了诸如肠道之类的动态系统的高度多样性，其营养供应和类型随着时间的变化而波动。 2.组成分型　基于群落组成结构的分类方法利于微生物的疾病诊断、治疗或预防，并在营养、微生物和药物干预方面对个性化治疗产生影响。在肠道菌群中，属水平的群落组成可以将样本很好地分组，即某些相对丰富的微生物的出现频率要高于其他物种。 这种菌群分布可以通过计算样本之间的生物距离研究分组，以及通过直接观察一些肠道微生物群丰度的复杂分布来验证。但是有许多样本处于不同的分组之间，很难用精确的数学的方法来描述这些偏好某种微生物的群落，也很难确定这类高度密集群的数量，这就促使人们采用另一种方式来描述这部分区域，即梯度结构（gradient，连续不可分型）（图1-3）。描述这些局部*优的群落组成，可以更好地理解生态限制和群落特性对群落结构的影响机制。 图1-3　人类肠道微生物群落组成分型 A.基于278个Meta HIT样本中肠型主要指示物种多度数据分析得到的beta多样性的理论分布模式（左）、实际分布模式（中）和肠型空间分布（右）；B.肠型地理分布；C.基于多元正态分布模拟微生物组成示意图，存在3个高密度主峰，每一种代表一种肠型，峰图可以更清晰地展示肠型的概念；D.同一群体基于不同分类方法定义的肠型 三、微生物稳态影响因素 健康成人肠道群落组成在很长一段时间内不会发生显著变化，表明成人体内生态系统与肠型状态普遍比较稳定。然而，也有例外，在分析HMP宏基因组时间序列数据中3种肠型稳定存在，但也有16%的样本肠型存在变化。这也表明，对于一些个体，肠型是可变的，且不存在明显的边界。证明这些模型需要有关微生物群落对不同干扰下反映的信息，从而确定个体是否有能力保持/恢复到原来的组成状态或肠型。虽然目前还不能预测特定的扰动将如何改变微生物组，但不同的微生物组结构，包括那些被定义的肠型结构，可能会在未来作为分类治疗和指导饮食的建议。 （一）抗生素 短期的抗生素治疗对人类肠道菌群的影响太剧烈，可以导致整个群落的瓦解，因此不适合研究肠道菌群的恢复能力。另外，抗生素对肠道菌群的严重破坏可导致病原的入侵，并使其无法恢复至*初的菌群状态。 （二）饮食 饮食干预对人类肠道菌群生态系统的影响更温和，适合于研究肠道菌群的可塑性。饮食干预可以在4天内导致肠型的改变，但是10天后趋于稳定，表明肠道菌群存在一种恢复至原始状态的能力。与之相比，长期的干预可能产生更深远的影响，长达一年的饮食干预可导致拟杆菌门/厚壁菌门比例发生变化，从而导致肠