表观遗传学技术前沿

**篇 表观遗传学概述及分析方法 **章 表观遗传学概述 表观遗传调控是当前分子遗传学研究的热点之一，同时也是基因表达调控的重要组成部分。目前其研究重点主要集中在组蛋白共价修饰、DNA甲基化、基因组印记、染色质重塑和非编码RNA等方面。目前，针对表观遗传修饰的研究方法取得了突飞猛进的进展，其表现在两方面：一方面，方法的特异性和灵敏度都在不断得到提高；另一方面，检测表观修饰的分析方法正在逐步从个别位点向高通量检测的方向发展，同时由定性检测向定量分析的方向发展。除此之外，随着研究的发现，新一代测序技术的应用将大大推动表观遗传研究的发展，这些技术包括单分子纳米孔测序法、单分子实时测序法等。近年来，随着不断深入研究，研究人员开发出各种研究方法以满足不同类型研究的需要。本篇目的在于主要介绍目前已有的表观基因组学研究方法并对其进行简要总结和分析。 一、表观遗传学发展历史 早在2000多年前古希腊哲学家亚里士多德在On the Generation of Animals一书中首先提出后生理论（the theory of epigenesis），它主要相对于先成论，其内容是描述新器官的发育由未分化的团块逐渐形成的。生物学家Waddington CH于1939年首先在《现代遗传学导论》中提出了“epigenetics”这一术语，并于1942年将表观遗传学划为生物学的一大分支，其是研究基因与决定表型的基因产物之间的因果关系。 科学家Hollidy R于1975年较为准确地描述了表观遗传学的基本信息。他认为表观遗传学不仅存在于发育过程中，而且可以在成体阶段研究可遗传的基因表达改变，这些信息能经过减数分裂和有丝分裂在个体和细胞间世代传递，而不借助于DNA序列的改变，简而言之，表观遗传是非DNA序列差异的核遗传。 二、表观遗传学概念 所谓表观遗传学是指研究的生物通过调控基因表达，同时却不改变基因序列所导致的遗传现象的理论。表观遗传学研究的重点是基因表达的调控机制方式，包括组蛋白共价修饰、DNA甲基化、基因组印记、染色质重塑和非编码RNA等调控方式。该理论*早是在1939年由英国学者Waddington CH在其著作《现代遗传学导论》中提出并形成的初步理论。表观遗传学是对经典遗传学的补充与进一步的发展，涉及何时、何地以何种方式去应用遗传学信息。我们认识的基因组包括两类遗传信息：即表观遗传学信息及DNA序列遗传信息。细胞及人体正常功能的维持均为这两种信息互相影响、保持动态平衡的结果，如果这两种因素的任何一种出现表达失衡，都有可能导致人体疾病的发生。因此，表观遗传学研究是生命科学中一个普遍而又至关重要、不可忽视的新的研究领域，其不仅在基因的表达、遗传、调控方面发挥重要作用，而且在生命发育、免疫、炎症、血管新生、衰老及再生医学、肿瘤发生、变异性疾病的发生与防治中起着极其重要的作用（表1-1-1）。综上所述，研究表观遗传学的重要性不亚于20世纪50年代沃森和克里克发现DNA双螺旋结构所引发的关于染色体上基因的研究。 表1-1-1 遗传学与表观遗传学的比较 三、表观遗传学的主要调节机制 表观遗传学的主要调节机制方式包括DNA甲基化、组蛋白甲基化与乙酰化及非编码RNA等三种方式。然而研究发现，机体生活的环境与这些调节机制的改变密切相关，每个生物个体都有特定的属于自己的基因组与表观基因组，表观基因组是指在不改变DNA序列的情况下抑制或激活基因的表达，而这种由表观基因组所调控的基因表达往往又受多种环境因素的影响。换句话说，机体日常呼吸的空气、饮用的水、食用的食物、所处的环境当中所潜在因素的影响均可对基因表达的关闭或开启产生巨大的影响和作用。因此，我们可以知道表观遗传学更加强调生活的环境对人体表观遗传因素的影响。 四、表观遗传学对基因的表达调控 （一）基因选择性表达的调控 基因选择性表达的调控包括DNA的甲基化、组蛋白的共价修饰、染色质重塑、X染色体失活和基因印记等。 1. DNA甲基化（DNA methylation） 是指在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下将甲基添加在DNA分子中的碱基上，这是一种极为常见且重要的表观遗传现象。我们常见的DNA甲基化通常发生在甲基位上，同时也可以与DNA链上的胞嘧啶（C）第5位碳原子间的共价结合形成5-甲基胞嘧啶（5mC）（图1-1-1）。除此以外，在腺嘌呤（A）N6位置可以引入一个甲基形成N6-甲基腺嘌呤（N6-mA），甲基化也可发生在此位点。研究证实，DNA甲基化在真核生物中主要发生在CpG二联核苷酸上，也常在植物基因组CNN和CNG序列上发现，在生物体基因序列的某些区域，CpG序列达到很高的密度，可达均值的5倍以上，成为含有C和G的富集区，我们称之为DNA序列海洋中的CpG岛（CpG islands）。DNA甲基化作为表观遗传学*重要的调控现象之一，对基因的表达发挥着重要的调控功能，涉及转座子扩散防御、异染色质形成、源基因表达调控、基因印迹、细胞分化和转基因沉默等，对生物的生命活动、新陈代谢有着重要的作用。 2. 组蛋白共价修饰（histone modification） 方式包括：乙酰化（acetylation）、甲基化（methylation）、核糖化（ribosylation）、磷酸化（phosphorylation）、类泛素化（sumoylation）和泛素化（ubiquitylation）等（图1-1-2）。这些修饰共同构成了可以通过特殊解码蛋白解读的组蛋白密码，并在解码过程中发挥作用，从而影响基因表达。在这么多的组蛋白的修饰方式中乙酰化和甲基化主要发生在组蛋白赖氨酸（-lys）残基上，研究发现乙酰化与转录激活有相关性；随之发现的组蛋白的甲基化既可能与转录抑制相关，也可能与转录激活相关，抑制或激活取决于所添加的甲基基团数目以及存在的甲基化lys位点，其中每个lys残基可以形成单甲基化、二甲基化、三甲基化三种形式（加上1～3个甲基基团）中的任意一种，每种形式都发挥其固有的、独特的功能。组蛋白的磷酸化是另外一种极其重要的调控方式，在DNA修复、基因转录、染色质凝聚及细胞凋亡等过程中发挥着重要作用。核糖化是指组蛋白H1、H2A、H2B及H3和多聚ADP-核糖的共价结合，研究者发现ADP-核糖基化是启动真核细胞内复制过程的扳机；而泛素化是指将被降解的蛋白质连接上泛素标记，事实证明一些可以诱导基因启动子区域的H2B组蛋白会被修饰以启动基因表达；类泛素蛋白（small ubiquitin-like modifiers，SUMO）对蛋白质的翻译后修饰与蛋白质的细胞内定位、转录活性和稳定性均有关，相关研究表明，其也可能参与异染色质结构的调节。近些年来，人们逐渐认识到表观遗传在基因表达调控方面的重要作用，并研究出一系列检测表观遗传修饰的方法，尤其是针对DNA甲基化和组蛋白修饰检测方法这方面取得了较大进展，到目前为止，检测方法的特异性和灵敏度都在不断得到提高；同时，表观修饰的检测正在逐步从个别位点向高通量检测的方向发展，逐步从定性检测向定量分析转向发展。 3. 染色质重塑 是指染色质结构和位置发生了变化，其主要涉及核小体在能量驱动下的重新排列或置换，结果便是它改变了基因启动子区内核小体的排列方式，增加了启动子和基因转录装置的可接近结合性。 真核生物遗传学过程的物质基础均是染色质，染色质构型整体和局部的动态改变是基因功能调控的相关因素。研究表明，组蛋白N端尾巴修饰和染色质重塑的发生密切相关，尤其是对组蛋白H3和H4的修饰调节。组蛋白的修饰可以直接影响核小体的结构，同时也为其他蛋白提供了DNA作用的结合位点。目前，染色质重塑主要包括两种类型：一类是依赖ATP的物理修饰，即利用ATP水解后释放的能量将DNA和组蛋白的结合分开，使转录能够顺利进行下去；另一类是含有组蛋白脱乙酰酶和乙酰转移酶的化学修饰类型，即依靠水解ATP来提供所需的能量，使得染色质重塑复合物可完成染色质结构的改变，根据水解ATP的亚基不同，可将复合物分为ISW复合物、SWI/SNF复合物及其他类型的复合物。研究证实，这些复合物及相关的蛋白均与转录的抑制和激活、细胞周期、DNA修复及DNA的甲基化呈一定的相关性。 4. 基因印记 又称遗传印记，是指基因的表达与否取决于它们是在母源染色体上，还是在父源染色体上以及母源染色体或父源染色体上的基因是否发生沉默，继而是如何表达出来。基因印记是通过生化途径，在某个基因或基因组域上标记其双亲来源信息的生物学过程。研究表明，有些印记基因只从父源染色体上表达，相应地有些则只从母源染色体上表达。基因组印记可以是非共价标记（如核基因组定位，DNA-蛋白质相互作用及DNA-RNA相互作用），也可以是共价标记（DNA甲基化）上的，印记的方法包括维持整个细胞周期中双亲表观记号的、特化的、核内酶的作用方法。研究者发现在胚胎中，来自不同亲本的IGF2甲基化状态不同，但成年后形成配子时，甲基化状态就会发生重设，形成新的状态。研究发现，基因组印记是一种正常的过程，这种现象在一些植物和低等动物中已被发现多年。通常，印记的基因只占人类基因组中的少数，可能不超过5%，但印记基因在胎儿的行为和生长发育中起着至关重要的作用，一旦不表达其作用大大受到抑制。大量研究发现，基因组印记病主要表现为生长迟缓、过度生长、行为异常、智力障碍等行为特征。目前，在肿瘤的研究中认为印记缺失是引起肿瘤*常见的遗传学因素之一，受到广大实验者的重视。 （二）基因转录后的调控 基因转录后的调控物质包括微小RNA（microRNA，miRNA）和小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），两者均为翻译后进行修饰剪切形成的产物。 miRNA和siRNA均为非编码的RNA。它们是两种序列特异性转录后基因表达的调节因子。miRNA的长短与siRNA相似，均为22bp左右，多数miRNA具有高度的保守性、基因表达组织特异性和时序性三大特点。miRNA的研究已成为当前生物医学研究的前沿热点之一，尤其是miRNA与肿瘤的关联日渐成为人们关注的重点方向，针对miRNA与肿瘤的治疗产生了特异性的靶点。如果某一miRNA特异性表达于某一肿瘤，那么该miRNA就可用于肿瘤的早期预测，也可特异性导入某一miRNA或特异性敲除某一miRNA来用于肿瘤的治疗，这些目前均已开始应用到临床，如图1-1-3所示为miRNA的研究思路。除此之外，DNA甲基化、组蛋白乙酰化等方面也与miRNA之间存在相互影响，因而这些构成了细胞基因调控系统*为复杂的调控网络。自从科学家沃森和克里克对DNA结构进行了完美的阐释后，从某种疾病发病机制的研究到疾病治疗方案或方法的确定，使生命科学从此踏入了基因时代，引来了时代的新潮。随之人类基因组计划（human genome project，HGP）成果的公布，把全世界几十年的目光都聚焦在以中心法则为核心的染色体基因组学上。直到表观遗传的提出，这无疑是为基因组学的研究开拓了一个新的领域。目前，表观遗传学已成为*新、*炙手可热的研究热点。研究人员发现，表观遗传学可以从更微观的视角、从更深的层次来解释许多目前基因组学无法解释的难题，攻克更多的问题，如同卵双生的兄弟日后为何会产生如此大的差异，环境因素究竟如何影响性状等方面。尽管迄今为止对表观遗传的研究仍然十分短暂，但人类已经取得了一定的成就。 图1-1-3 miRNA的研究思路 五、表观遗传学研究的应用进展 先前的研究发现多种疾病与表观遗传调控及表观特征的变化息息相关，这些疾病的遗传特点不能够用精确的遗传方式来解释，同时随着年龄的增长，相关疾病会出现由于表观遗传变化的持续传递，随之出现长期积累而患病率增高的现象，这些会严重影响人们的生活质量及水平。由于表观遗传具有可逆性这