医学细胞生物学实验

**部分 验证性实验 实验1 普通光学显微镜的构造与使用 一、实验目的 （1）了解普通光学显微镜的构造及成像原理。 （2）掌握低倍镜、高倍镜和油镜的正确使用方法。 （3）初步了解光学显微镜的维护方法。 二、实验原理 普通光学显微镜是*通用的一种光学显微镜。利用光线照明，标本中各点依其光吸收的不同而在明亮的背景中成像。它由物镜、目镜、聚光镜、光源、载物台和支架等部件组成。其基本成像原理是：目镜、物镜、聚光器各自相当于一个凸透镜，被检标本置于聚光器与物镜之间，物镜可使标本在物镜的上方而形成一个倒立的放大实像（倒像）。目镜将此倒像进一步放大成像于人眼的视网膜上，形成一个直立的实像（正像）。显微镜中放大的倒立的虚像与视网膜上直立的实像是相吻合的，该虚像看起来好像在离眼睛250mm处（图1-1）。 三、实验仪器、材料和试剂 1. 器材 普通光学显微镜、擦镜纸。 2. 试剂 镜头清洗剂、香柏油或油镜专用油等。 3. 材料 文字装片或毛发装片、血涂片。 四、方法与步骤 （一）普通光学显微镜的基本构造 光学显微镜主要由三部分组成：机械部分、照明部分和光学部分（图1-2）。 图1-2 普通光学显微镜的结构示意图（引自章静波等，2004） 1. 机械部分 显微镜的机械部分是显微镜的重要组成部分。其作用是固定与调节光学镜头，固定与移动标本等。主要有镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器与调焦装置等组成。 （1）镜座：作用是支撑整个显微镜，装有反光镜，有的还装有照明光源。 （2）镜柱：镜座上面直立的短柱，连接镜座和镜臂。 （3）镜臂：作用是支撑镜筒和载物台，分固定、可倾斜两种。 （4）镜筒：上端放置目镜，下端连接物镜转换器。分为固定式和可调节式两种。机械筒长（从目镜管上缘到物镜转换器螺旋口下端的距离称为镜筒长度或机械筒长）不能变更的称作固定式镜筒，能变更的称作调节式镜筒，新式显微镜大多采用固定式镜筒，国产显微镜也大多采用固定式镜筒，国产显微镜的机械筒长通常是 160mm。 安装目镜的镜筒，有单筒和双筒两种。单筒又可分为直立式和倾斜式两种，双筒则都是倾斜式的。其中双筒显微镜，两眼可同时观察以减轻眼睛的疲劳。双筒之间的距离可以调节，而且其中有一个目镜有屈光度调节（即视力调节）装置，便于两眼视力不同的观察者使用。 （5）载物台（又称工作台、镜台）：作用是安放载玻片，形状有圆形和方形两种，其中方形的面积为120mm×110mm。中心有一个通光孔，通光孔后方左右两侧各有一个安装压片夹用的小孔。分为固定式与移动式两种。有的载物台的纵横坐标上都装有游标尺，一般读数为0.1mm，游标尺可用来测定标本的大小，也可用来对被检部分做标记。 （6）物镜转换器：固定在镜筒下端，有3～4个物镜螺旋口，物镜应按放大倍数高低顺序排列。旋转物镜转换器时，应用手指捏住旋转碟旋转，不要用手指推动物镜，因时间长容易使光轴歪斜，使成像质量变坏。 （7）调焦装置：显微镜上装有粗调节器（粗准焦螺旋）和细调节器（细准焦螺旋）。有的显微镜粗准焦螺旋与细准焦螺旋装在同一轴上，大螺旋为粗准焦螺旋，小螺旋为细准焦螺旋；有的则分开安置，位于镜臂的上端较大的一对螺旋为粗准焦螺旋，其转动一周，镜筒上升或下降10mm。位于粗准焦螺旋下方较小的一对螺旋为细准焦螺旋，其转动一周，镜筒升降值为0.1mm，细准焦螺旋调焦范围不小于1.8mm。 2. 照明部分 安装在载物台下方，包括反光镜（或照明光源）、聚光镜、光圈。 （1）反光镜（或照明光源）：是一个可以随意转动的双面镜，一面为平面，一面为凹面，其作用是将从任何方向射来的光线经通光孔反射上来。平面镜反射光线的能力较弱，是在光线较强时使用，凹面镜反射光线的能力较强，是在光线较弱时使用。观察完毕后，应将反光镜垂直放置。电光源普通显微镜没有反光镜，一般在镜座内安装有照明装置，光线的强弱由底座上或镜臂上的光亮调节钮控制。 （2）聚光器：也称集光器。位于标本下方的聚光器支架上。它主要由聚光镜和光圈组成。其中，聚光镜可分为明视场聚光镜（普通显微镜配置）和暗视场聚光镜。 数值孔径（NA）是聚光镜的主要参数，*大数值孔径一般是1.2～1.4，数值孔径有一定的可变范围，通常刻在上方透镜边框上的数字代表*大的数值孔径，通过调节下部可变光阑的开放程度，可得到此数字以下的各种不同的数值孔径，以适应不同物镜的需要。有的聚光镜由几组透镜组成，*上面的一组透镜可以卸掉或移出光路，使聚光镜的数值孔径变小，以适应低倍物镜观察时的照明。 聚光镜的作用相当于凸透镜，起会聚光线的作用，以增强标本的照明。一般把聚光镜的聚光焦点设计在它上端透镜平面上方约1.25mm处（聚光焦点正要观察的标本上，载玻片的厚度为1.1mm左右）。 光圈也称可变光阑，位于聚光镜的下方，由十几张金属薄片组成，中心部分形成圆孔。其作用是调节光强度和使聚光镜的数值孔径与物镜的数值孔径相适应。可变光阑开得越大，数值孔径越大（观察完毕后，应将光圈调至*大）。 在可变光阑下面，还有一个圆形的滤光片托架。滤光片安装在光源和聚光器之间。作用是让所选择的某一波段的光线通过，而吸收掉其他的光线，即改变光线的光谱成分或削弱光的强度。 3. 光学部分 （1）物镜：是决定显微镜性能的*重要部件，安装在物镜转换器上，接近被观察的物体，又称接物镜。物镜根据使用条件的不同可分为干燥物镜和浸液物镜；其中浸液物镜又可分为水浸物镜和油浸物镜（常用放大倍数为90～100倍）。根据放大倍数的不同可分为低倍物镜（10倍以下）、中倍物镜（20倍左右）和高倍物镜（40～65倍）。 （2）目镜：因为它靠近观察者的眼睛，因此也称接目镜，安装在镜筒的上端。通常目镜由上下两组透镜组成，上面的透镜称作接目透镜，下面的透镜称作会聚透镜或场镜。上下透镜之间或场镜下面装有一个光阑（它的大小决定了视场的大小），因为标本正好在光阑面上成像，可在这个光阑上粘一小段毛发作为指针，用来指示某个特点的目标；也可在其上面放置目镜测微尺，用来测量所观察标本的大小。目镜的长度越短，放大倍数越大（因目镜的放大倍数与目镜的焦距成反比）。目镜是将已被物镜放大的、分辨清晰的实像进一步放大，达到人眼能容易分辨清楚的程度。常用目镜的放大倍数为5～16倍。 （二）普通光学显微镜的性能和质量 1. 目镜与物镜的关系 物镜已经分辨清楚的细微结构，假如没有经过目镜的再放大，达不到人眼所能分辨的大小，那就看不清楚；但物镜所不能分辨的细微结构，虽然经过高倍目镜的再放大，也还是看不清楚，所以目镜只能起放大作用，不会提高显微镜的分辨率。有时虽然物镜能分辨开两个靠得很近的物点，但由于这两个物点的像的距离小于眼睛的分辨距离，还是无法看清。所以，目镜和物镜既相互联系，又彼此制约。 2. 放大倍数 显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。 放大倍数是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。例如，放大倍数为100×，指的是长度是1μm的标本，放大后像的长度是100μm，要是以面积计算，则放大了10 000倍。 3. 数值孔径 也称镜口率，简写为NA或A，是物镜和聚光器的主要参数，与显微镜的分辨力成正比。干燥物镜的数值孔径为0.05～0.95，油浸物镜（香柏油）的数值孔径为1.25。 4. 工作距离 是指当所观察的标本*清楚时物镜的前端透镜下面到标本的盖玻片上面的距离。物镜的工作距离与物镜的焦距有关，物镜的焦距越长，放大倍数越低，其工作距离越长。例如，10倍物镜上标有10/0.25和160/0.17，其中10为物镜的放大倍数；0.25为数值孔径；160为镜筒长度（单位mm）；0.17为盖玻片的标准厚度（单位mm）。10倍物镜有效工作距离为6.5mm，40倍物镜有效工作距离为0.48mm。 5. 分辨力 也称分辨率或分辨本领。分辨力的大小是用分辨距离（所能分辨开的两个物点间的*小距离）的数值来表示的。在明视距离（25cm）之处，正常人眼所能看清相距 0.073mm的两个物点，这个0.073mm的数值，即为正常人眼的分辨距离。显微镜的分辨距离越小，即表示它的分辨力越高，也就是表示它的性能越好。 显微镜分辨力的大小是由物镜的分辨力来决定的，而物镜的分辨力又是由它的数值孔径和照明光线的波长决定的。 当用普通的中央照明法（使光线均匀地透过标本的明视照明法）时，显微镜的分辨距离为 d=0.61λ/NA 式中d——物镜的分辨距离，单位nm。 λ——照明光线波长，单位nm。 NA——物镜的数值孔径。 例如，油浸物镜的数值孔径为1.25，可见光波长范围为400～700nm，取其平均波长550nm，则d=270nm，约等于照明光线波长一半。一般地，用可见光照明的显微镜分辨力的极限是0.2μm。 6. 焦点深度 当把焦点对准某一物点时，不仅位于该点平面上的各个点可看得清楚，而且在平面的上下一定厚度内也能看得清楚，这个清晰部分的厚度就是焦点深度。焦深与总放大率和镜口率成反比，因此高放大率和高镜口率显微镜的焦点深度就浅，不能看到标本的全厚度，必须调节螺旋改变焦距，并仔细地从上到下进行观察。 7. 视场亮度 是指光学显微镜的整个视场的明暗程度。在使用光镜时，不更换物镜和目镜的情况下，视场亮度大，观察到的图像也就大。 （三）显微镜的使用方法 1. 用前的准备工作 （1）打开镜箱，右手握住镜臂，左手托住镜座，小心地把显微镜从镜箱内取出，轻轻地放在实验桌上。 （2）检查显微镜的各部件是否完整和正常，如发现有部件损坏或出现故障，应立即停止使用，待排除故障或修复后，才能继续操作。 2. 低倍镜的使用 （1）准备：将显微镜放于前方略偏左侧，必要时使镜筒倾斜（有的显微镜本身已经倾斜）以便观察。转动粗调节器，将镜筒略升高（或将载物台下降）使物镜与载物台距离拉开。以免物镜与载物台相碰。然后旋转物镜转换器，将低倍镜对准载物台中央的通光孔（可听到“咔哒”声）。 （2）对光：打开光圈，上升聚光器，双眼同时睁开，以左眼向目镜内观察，双手并用，左手调焦，右手移片或绘图记录，同时调节反光镜的方向，使视野内的光线均匀，亮度适中。 （3）放标本片：标本片的盖片朝上，将标本片放到载物台前方，然后推到物镜下面，用压片夹压住，如有标本移动器，可用上面的弹簧夹夹住标本片，然后把要观察的部分移到通光孔的正中央。 （4）调节焦距：从显微镜侧面注视物镜镜头，同时旋转粗调节器，使镜筒缓慢下降（或镜台上升），低倍镜的镜头端与玻片间的距离约5mm时，再用左眼从目镜里观察视野，左手慢慢转动粗调节器，使镜筒缓缓上升，直至视野中出现物像。如物像不太清晰，可转动细调节器，使物像达到*清晰为止。 如果按上述操作步骤仍看不到物像时，可能由以下原因造成：①转动调节器太快，超过焦点，应按上述步骤重新调节焦距。②物镜没有对正，应对正后再观察。③标本没有放到视野内，应移动标本片寻找观察对象。④光线太强，尤其观察比较透明的标本或没有染色的标本时，易出现这种现象，应将光线调暗一些后再观察。 3. 高倍镜的使用 （1）依照上述操作步骤，先用低倍镜找到清晰物像。 （2）将需要观察的部分移到视野的中央。 （3）眼睛从侧面注视物镜，用手移动转换器，换高倍镜。 （4）眼睛向目镜内观察，同时微微上下转动细调节器，直至视野内看到清晰的物像为止。 如按上述操作仍看不到