生物化学与分子生物学实验

总论 生物化学与分子生物学是当代生命科学领域中一门重要的基础学科，它涵盖的基础理论、基本知识、基本技术与医学研究各学科领域密切相关，其理论与技术的发展，推动了生命科学的发展，对人类的科技进步与文明产生巨大影响。生物化学实验是生命科学相关专业学生必修的一门独立的基础实验技术课程，其研究技术的发展与应用是依据物理学、化学及生物学的基本理论和实验方法而建立起来的。20世纪20年代微量分析的发展，30年代电子显微镜的出现，40年代层析技术和电泳技术的兴起，以及同位素示踪技术、各种光谱技术、核磁共振技术的应用，激光、超导等新技术的出现，电子计算机技术的突飞猛进，使生物化学实验手段提高到一个崭新的水平，掌握生物化学实验方法和研究技术，对生命科学相关专业学生来说是十分重要的。 本门课程主要侧重于给学生以基本实验方法和基本实验技能的训练，让学生了解并掌握生物化学的四大基本实验方法，即：分光光度法、离心法、层析法和电泳法。同时也注意引进一些新近发展起来的生物化学及分子生物学重要研究技术，作为学生学习其他专业课程和进入科学研究领域的准备。 一、实验要求 1.实验前必须预习实验指导和相关理论，明确实验目的、原理、预期的结果、操作关键步骤及注意事项。 2.实验时要严肃认真专心进行操作，注意观察实验过程中出现的现象和结果，结果不良时，必须重做。 3.实验中，应及时将实验结果如实记录下来，并请老师当场审核。根据实验结果进行科学分析，按时将实验报告交教师评阅。 二、实验记录要求 实验记录应及时、准确、如实、详尽、清楚。 “及时”是指在实验中将观察到的现象、结果、数据及时记录在实验报告本上(每个实验报告前一页作为实验记录专用页)。回顾性的记录容易造成无意或有意的失真。 实验结果的记录不可掺杂任何主观因素，不能受现成资料及他人实验结果的影响。若出现“不正常”的现象，更应如实详尽记录。 表格式的记录方式简练而清楚，值得提倡使用。记录时字迹必须清楚，不提倡使用易于涂改及消退的笔墨做原始记录。 简单的实验记录应包括日期、题目(内容)、现象及结果(包括计算结果及各种图表)。使用精密仪器进行实验时还应记录仪器的型号及编号。 实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。 三、实验报告要求 完整的实验报告应包括实验名称、实验日期、目的要求、实验原理、试剂、仪器设备、操作方法、实验结果、讨论、实验结论等多项内容。 其中，目的要求、原理、设备、试剂及操作方法等项只要求作简明扼要的叙述，不必也不应将《实验指导》原版抄录一遍。但对实验的条件、操作要点等实验成败的关键环节应作清楚描述。 实验结果首先是如实记录实验中观察到的现象及各种原始数据，还应包括根据实验要求整理、归纳数据后进行计算的过程及计算结果，根据实验数据及计算做出的各种图表(如曲线图、对照表等)。 讨论部分不是对结果的重述，而是对实验结果、实验方法和异常现象进行解析和评论，以及对实验设计的认识、体会及建议。 一般要有实验结论。结论要简单扼要，以说明本次实验所获得的结果。如在临床生化检验项目中，可评价样本检出值与相应正常值之间的异同及其临床意义。 四、实验时注意事项 1.进实验室要穿好实验服，以避免给实验带来不可预知的结果，或造成酸碱腐蚀衣服。 2.进实验室前准备好实验指导、课本、笔记、实验记录本、报告本、文具等。其他非实验所需物品严禁带入实验室。 3.保持实验台整洁，试剂、仪器应整齐，按次序放置。实验完毕要按各类仪器的清洗方法和要求将仪器清洗干净。 4.实验室是培养学生独立思考、独立工作能力及良好科学作风的重要场所，操作务必认真，不得敷衍，室内应保持肃静，不得吸烟、玩闹，不得随地吐痰，不得乱丢纸屑。实验后要清扫实验台面、地面、试剂瓶要码放整齐。 5.爱护仪器、节约药品。**次实验时要按仪器清单清点仪器，负责保管，用后如数交还。在使用时如有破损，及时报告，经指导教师检查后填写破损单，按学校规定赔偿。 6.贵重仪器，如分光光度计、离心机等，应当爱护，使用前应熟悉使用方法，严格遵守操作规程，严禁随意开动。 7.节约水电，一经用完随手关闭水龙头、电闸。 五、值日生任务 1.领发本次所用仪器、物品，清点、交还临时用仪器、物品，若有损坏负责追查赔偿。 2.管理操作公用仪器，打蒸馏水。 3.搞好实验室卫生，做到仪器、桌面、地面、水池等干净、整齐。 4.确保安全，管好仪器、门窗、水电。 5.请任课及技术室老师检查工作，认可后方能离开实验室。 六、试剂使用规则 1.使用试剂前应仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需要。 2.取出试剂后，立即将瓶塞盖好，切勿盖错，放回原处。试剂瓶塞、专用吸量管、滴管不得与试剂瓶分家，以免错用而污染试剂，造成自己或他人实验的失败。未用完的试剂不得倒回瓶内。 3.取标准溶液时，应先将标准液倒入干净试管中，再用清洁吸管吸取标准液，以免污染瓶中的标准溶液。 4.使用滴管时，滴管尖端朝下，切勿倒置，勿使试剂流入橡皮帽内。 5.使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒量取，若用吸管时只能用洗耳球吸取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。 七、安全注意事项 1.低沸点有机溶剂，如乙醚、石油醚、酒精等均系易燃物品，使用时应禁明火、远离火源，若需加热要用水浴加热，不可直接在火上加热。 2.凡属发烟或产生有毒气体的化学实验，均应在通风橱内进行，以免对人体造成危害。 3.若发生酸碱灼伤事故，先用大量自来水清洗，酸灼伤者用饱和NaHCO3溶液中和，碱灼伤者用饱和H3BO3溶液中和，氧化剂伤害者用Na2S2O4处理。 4.若发生起火事件，根据发生起火性质分别采用砂、水、CO2或CCl4灭火器扑灭。 5.离开实验室必须关好窗户，切断电源、水源，以确保安全。 八、废弃物处理 1.所有固体废弃物如：用过的滤纸、棉花、碎屑沉淀物等必须倾弃于垃圾筒中。 2.浓酸必须弃于小钵中，用水稀释后倒入水池中。 3.实验完成后之沉淀或混合物含有可提取之贵重药品者不可随意舍弃，应交教师保存。 **篇 生物化学与分子生物学实验基本操作、基本技术及原理 **章 生物化学与分子生物学实验基本操作 一、玻璃仪器的洗涤与清洗 生物化学实验常用各种玻璃仪器，其清洁程度将直接影响实验结果的可靠性。因此，玻璃仪器的清洁不仅是实验前后的常规工作，而且是一项重要的基本技术。 玻璃仪器的清洗方法很多，需要根据实验的要求，以及污物性质选用不同的清洁方法。 1.新购仪器的清洗新购仪器表面附着油污和灰尘，特别是附着有可游离的金属离子。因此，新购仪器需要用肥皂水刷洗，流水冲净后，浸于10%Na2CO3溶液中煮沸。用流水冲净后，再浸泡于1%～2%HCl溶液中过夜。流水洗净酸液，用蒸馏水少量多次冲洗后，干燥备用。 2.使用过的玻璃仪器的清洗 (1)一般非计量玻璃仪器或粗容量仪器，如试管、烧杯、量筒等，先用肥皂水刷洗，再用自来水冲洗干净，*后用蒸馏水冲洗2～3次后，倒置于清洁处晾干。 (2)容量分析仪器，如吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自来水冲洗，沥干后，浸于铬酸洗液浸泡数小时。然后用自来水和蒸馏水冲洗干净，干燥备用。 (3)比色杯，用毕立即用自来水反复冲洗，如有污物粘附于杯壁，宜用盐酸或适当溶剂清洗。然后用自来水、蒸馏水冲洗干净。切忌用刷子、粗糙的布或滤纸等擦拭。洗净后，倒置晾干备用。 二、吸量管的种类和使用 吸量管是生化实验*常用的仪器之一，测定的准确度与吸量管的正确选择和使用有密切关系。 1.吸量管的分类常用的吸量管可以分为三类，见图1-1-1。 (1)奥氏吸量管：供准确量取0.5、1.0、2.0、3.0ml液体所用。此种吸量管只有一个刻度，当放出所量取的液体时，管尖余留的液体必须吹入容器内。 (2)移液管：常用来量取50、25、10、5、2、1ml的液体，这种吸量管只有一个刻度，放液时，量取的液体自然流出后，管尖需在容器内壁停留15秒钟，注意管尖残留液体不要吹出。 (3)刻度吸量管：供量取10ml以下体积的溶液。一般刻度包括尖端部分。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖的溶液。此类吸量管为“吹出式”，吸量管上端标有“吹”字。未标“吹”字的吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。 图1-1-1三类吸量管简图 1、2：刻度吸量管3：奥氏吸量管4：移液管 2.吸量管的使用 (1)选用原则：准确量取整数量液体，应选用奥氏吸量管。量取大体积时要用移液管。量取任意体积的液体时，应选用量程与取液量*接近的吸量管。如欲取0.15ml液体，应选用0.2ml的刻度吸量管。同一定量试验中，如欲加同种试剂于不同管中，并且取量不同时，应选择一支量程与*大取液量*接近的刻度吸量管。如各试管应加的试剂量为0.30、0.50、0.70、0.90ml时，应选用一支量程为1.0ml的刻度吸量管。 (2)吸量管的使用：使用吸量管时，用拇指和中指夹住近顶端部分，将管的下端插入液体，用洗耳球吸入液体到需要刻度标线上1～2cm处(插入液面下的部分不可太深，也不可太浅，防止空气突然进入管内，将溶液吸入洗耳球内)，用食指封闭上口将已充满液体的吸量管提出液面，把吸量管提到与眼睛同一水平线上，然后小心松开上口，调节液面至需要的刻度处。将吸量管移到另一容器，松开上口，使液体自由流出。*后再根据规定吹出或不吹出尖端的液体，见图1-1-2。 图1-1-2放液体时的姿势 3.可调式移液器的使用 (1)可调式移液器的结构，见图1-1-3。 (2)可调式移液器的操作，见图1-1-4。 1)旋转调节轮至所需体积值。 2)套上吸头，旋紧。 3)垂直持握可调式移液器用大拇指按至**档。 4)将吸头插入溶液，徐徐松开大拇指，使其复原。 图1-1-3可调式移液器的结构 图1-1-4持移液器的姿势 注：推动按钮内部的活塞分2段行程，**档为吸液，第二档为放液，手感十分清楚 5)将可调式移液器移出液面，必要时可用纱布或滤纸拭去附于吸头表面的液体(注意：不要接触吸头孔口)。 6)排放时，重新将大拇指按下，至**档后，继续按至第二档以排空液体。 注：移取另一样品时，按卸尖按钮弃掉吸头并更换新吸头。 三、混匀 样品和试剂的混匀是保证化学反应充分进行的一种有效措施。为使反应体系内各物质迅速地接触，必须借助于外力的机械作用。常用的混匀方法有以下几种： 1.旋转法手持容器，使溶液作离心旋转。适用于未盛满液体的试管或小口器皿，如锥形瓶。 2.指弹法一手执试管上端，另一只手轻弹试管下部，使管内溶液作旋涡运动。 3.搅动法使用玻璃棒搅匀，多用于溶解烧杯中的固体。 4.电磁搅拌混匀 5.混匀器法将容器置于混匀器的振动盘上，逐渐用力下压，使内容物旋转。 注：混匀时谨防容器内液体溅出或被污染；严禁用手堵塞管口或瓶口振摇。