酶工程(第二版)

1 酶工程 【内容提要】本章主要讲授：①重点介绍酶和酶工程的研究简史和发展概况；②简要回顾酶催化特点、影响酶活性的因素、酶活力测定方法及酶反应动力学。 1.1 酶工程概述 1.1.1 酶及酶工程研究的意义及内容 生命依赖于一系列有条不紊的化学反应。然而化学反应的速度太慢以至于无法维持生命活动，因此生命系统进化出加快化学反应的物质——酶。酶是具有特殊作用的蛋白质，能够在生命体内（包括动物、植物和微生物）催化一切化学反应，维持生命特征。从1833年法国的帕耶恩( Paven)和珀索兹(Personz)发现**个酶（淀粉酶）起，至今已发现的酶逾5000种，这些酶都是由生物体自然产生的具有催化功能的蛋白质。有关酶的研究内容主要包括酶的结构和功能、生产和改造，以及应用等领域。近40年以来，随着核酶、抗体酶、模拟酶及印迹酶的出现，扩展了人们对酶的认识。随着20世纪70年代DNA重组技术的出现，对酶的研究深入到分子水平，包括研究酶的编码基因、酶的表达和调节，进一步通过蛋白质工程对酶分子进行改造。美国能源部于2002年斥资3.5亿美元启动了“从基因组到生命(GTL)”的五年计划，利用系统生物学的研究方法对生命现象进行研究，从分子水平来探讨酶与生命活动、代谢调节、遗传疾病及生长发育的关系，对阐明生命现象的本质具有重要的意义。 酶不仅是研究的重要对象，也是重要的研究工具。DNA重组技术的实现和发展得益于技术上的三大发现，其中两大发现就直接与酶相关，即限制性核酸内切酶的发现和DNA连接酶及反转录酶的发现。1985年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的穆利斯(mullis)等发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应(PCR)，此后几年时间该研究小组致力于DNA聚合酶的研究，直到1988年taq DNA聚合酶的发现，才使得PCR反应广泛运用于各个领域。分子生物学的这一重要发现改变了整个生命科学研究的方式。可以毫不夸张地说，没有酶就没有基因工程。 现代生物技术、航天技术、信息技术、激光技术、白动化技术、新能源技术和新材料技术是世界七大高新技术，其中生物技术列在首位。生物技术之所以令世界各国如此重视，不仅是因为它在解决人类所面临的诸如食物短缺、人类健康、环境污染和资源匮乏等重大问题上有着不可比拟的优越性，还因为它与理、工、农、医等科技的发展，与伦理道德、法律等社会问题都有着密切的关系。生物技术主要包括基因工程，细胞工程、酶工程及发酵.工程，酶是基因工程、细胞工程和发酵工程的重要研究对象和工具。酶工程的研究可以促进基因工程、细胞工程和发酵工程的发展。因此，酶工程是生物技术研究的核心内容。酶工程研究的主要内容包括酶的发酵丁程、酶的分离工程、酶的固定化、化学酶工程、生物酶工程、酶反应器和传感器、酶的非水相催化、酶抑制剂及酶的应用。酶工程研究的*终目的就是为了获得大量所需要的酶，并能高效利用所得的酶。酶工程的研究包括生物化学、分子生物学、基因工程、细胞工程、发酵工程、医学、免疫学、有机化学、分析化学及仿生学等多学科交叉。酶工程的应用遍及人类社会的各个领域，日益受到重视。 1.1.2 酶的研究简史 1.1.2.1 酶的原始利用 中国古代对酶的利用可以追溯到4000年前的夏禹时代，当时的酿酒技术就是利用存在于酒曲中微生物的淀粉酶系和酒化酶系。公元前10世纪左右，利用豆类制造豆酱是我国民间盛行的技术，其原理就是利用霉菌产生的蛋白酶水解豆类蛋白。2700年前的周代，人们利用麦芽中含有的3-淀粉酶制造麦芽糖，至今这种传统的制糖技术依然盛行。由于酒曲中含有丰富的维生素和淀粉酶，早在2500年前，人们就知道利用酒曲治疗消化疾病。春秋战国时期，漆已经被广为利用，那时所用的漆即为漆树的树脂被漆酶作用的氧化产物。 西方*早有关酶利用的记载是约6000年前，古巴比伦人利用麦芽酿酒。在古埃及时代的绘画中就详细描述了使用酵母发酵面包的过程，公元前2575年建造的Giza金字塔群附近就挖掘出面包房遗址，大英博物馆陈到着公元前2100年的面包样品。以上这些事例都是人们对酶的原始利用。 1.1.2.2 酶的发现和发展 科学研究中的很多发现表面上看似乎都是一些偶然的事件，仔细分析就会认识到这些发现实质上都是偶然中的必然。正如法国微生物学家、化学家巴斯德( Pasteur)所说：“在观察的领域中，幸运只偏袒有准备的头脑”。酶的现代史可以追溯到1833年。在Annales de Chemie et de Physique期刊上帕耶恩和珀索兹描述了从大麦的麦芽中分离淀粉酶多聚体的过程，并将其命名为淀粉酶。和麦芽一样，该产物将糊化淀粉转变成糖，主要是麦芽糖。1835年，瑞典的贝采里乌斯(Berzelius)首次证明了麦芽提取物能够比硫酸更有效地降解淀粉，并将这一过程称为催化。这是首次在植物中发现酶的存在并且初步验证了它的功能。1836年，德国生理学家施旺(Schwann)在研究消化过程时，分离出一种在胃内消化蛋白质的物质，将它命名为胃蛋白酶，这是**个从动物组织中提取到的酶。酵母在发酵过程中的作用是什么？这一问题被激烈地争论了60年。1839年，杰出的德国化学家李比希(Liebig)建立了一个模型，来阐述酵母在发酵过程中的作月。他把在发酵混合液中的酵母看作是一个能产生震荡的分解物质：蔗糖原子经过重排，变为乙醇和二氧化碳。另外，乙醇发酵一直被认为是自发的过程。到1858年，巴斯德用一系列文章证明发酵仅在活体细胞状态下才会发生，即是与生命相关的现象——巴斯德视其为一种生理活动。这种对酵母在发酵过程中作用机制的分歧，引发了李比希和巴斯德之间的激烈争论。李比希和巴斯德先后于1873年和1895年去世，但争论并没有结束。后来德国化学家爱德华 巴克纳(Eduard Buchner)和汉斯 巴克纳(Hans Buchner)于1897年发现酵母细胞提取物可以使乙醇发酵，即酵母细胞产生一种酶，这种酶引起发酵。李比希和巴斯德之间的争论就这样*终得到解决。巴克纳兄弟由此奠定了现代生物化学的基石，他们证明酵母细胞提取物可以像活体酵母细胞一样将葡萄糖转变为乙醇和二氧化碳。换句话说，这一转变并不依赖于酵母细胞，而是依赖于无生命的酶。巴克纳兄弟由此获得1907年的诺贝尔化学奖，这是酶学研究史上**次获得诺贝尔奖。酶的命名是1876年库尼( Kuhne)提议的，用酶来表示未统一名称的已知的各种酵素，如从活体组织中提取的酵素等。enzvme本身的意思是“在酵母中”，起源于希腊语，其中en表示“在之内”，zvme表示酵母或酵素。真正意义上的酶学研究应该始于巴克纳兄弟的发现。 1883年，丹麦化学家基耶达( Kjeldahl)建立了一套检测有机物中-3价氮的方法，即测定氮含量的方法。白蛋白质被确定是由含氮的氨基酸组成的高分子物质后，这一方法是定量酶学和普通生物技术发展的基础。这种测定蛋白质含量的方法即凯氏定氮法，至今还在沿用。 1894年，德国化学家费歇尔( Fisher)根据糖化酶的特点建立了“锁钥学说”，提出酶的功能由底物分子的立体结构决定（如原子间的位置关系）。科什兰( Koshland)认为“锁钥学说”理论在真实的生命体系中会导致灾难性的副反应，1953年，他提出了“诱导契合”假说，解释了酶的其他许多现象，如荷尔蒙作用、反馈抑制和受体功能等。1963年，莫诺( monod)及其同事提出了“变构模型”，用以定量解释有些酶的活性可以通过结合小分子进行调节，从而提供了认识细胞中许多酶调控作用的理论基础。 酶动力学研究可以追溯到1902年，亨利( Henri)从为酶与底物结合成酶-底物中间复合物是酶催化作用的基本步骤。在此基础上，德国的米彻利斯( michaelis)和加拿大的曼吞(ment-en)在1913年数学化地表述了酶作用的普通理论，即米氏方程。他们假定酶(E)首先和底物(S)结合，成为酶-底物中间复合体(ES)，这是一个较快的可逆过程；然后复合物(ES)在下一个较慢的反应中分解成为产物(P)和游离的酶。1925年，布立格兹(Briggs)和何尔登(Handane)修正了米氏方程，提出了稳态学说。经过近百年的验证，米氏方程已经被证明能够精确描述数千种不同酶类的整体动力学行为。在2006年2月出版的《自然——化学生物学》上，研究人员描述米氏方程实际上在单分子水平上同样是有效的，这也强调了酶分子的个性特征。 在蛋白质酶结构研究领域，萨姆纳( Sumner)作出了开创性的工作。1926年，他从刀豆分离并结晶了脲酶，证明了酶的本质是蛋白质。并由此获得了1946年诺贝尔化学奖，这是酶学研究史上的第二次诺贝尔奖。同年，丹麦科学家Lindestroem-Lang在哥本哈根的Carlsberg实验室研究了多种蛋白质的重要化学性质。他于1924午出版的《酶的分离》一书奠定了酶生产的理论基础。Lang的理论仍是**近似法，在解决一些分子结构未知的问题上得到应用。继萨姆纳在1926年证实酶是蛋白质之后，桑格(Sanger)利用纸电泳及层析技术于1953年首次阐明胰岛素的一级结构，开创了蛋白质序列分析的先河。肯德鲁( Kendrew)和佩鲁兹(Perutz)利用X射线衍射技术解析了肌红蛋白及血红蛋白的三维结构，论证了这些蛋白质在输送分子氧过程中的特殊作用，成为研究生物大分子空间立体构型的先驱（1962年诺贝尔化学奖）。1965年，菲利普斯(Phillips)等研究了溶菌酶的三维空间结构，从而阐明了酶的活性中心并推定了它对基质的反应机制。2002年诺贝尔化学奖授与美国的科学家芬恩( Fenn)、日本科学家田中耕-( Koichi tanaka)及瑞士科学家维特里希(Kurt Wuthrich)。芬恩和田中耕一发明了“对生物大分子进行确认和结构分析的方法”和“对生物大分子的质谱分析法”，维特里希开创了“利用核磁共振测定溶液中生物大分子三维结构的方法”。 1982年，切克(Cech)等在四膜虫RNA中发现核酶，26S rRNA前体能够进行内含子的自找剪切，形成成熟的26S rRNA。1983年，阿尔特曼(Altman)等发现，核糖核酸酶P中的RNA催化前体工RNA从工RNA 5 7端切除某些核苷酸片段，而成为成熟的工RNA。核酶的发现，从根本上改变了以往只有蛋白质才具有催化功能的概念，拓展了对酶的定义。切克和阿尔特曼也因此获得了1989年的诺贝尔奖。1995年，Cuenoud发现某些DNA分子也具有催化功能，这就彻底改变了酶是蛋白质的传统观念，也为先有核酸后有蛋白质提供了进化的证据。2007年，美国加州大学圣克鲁兹分校化学和生物化学副教授威廉 斯科特确定了核糖核酸酶晶体结构，为生命起源提供新的视角。 1.1.2.3 酶工程的发展概况 酶的开发和利用是当代新技术革命中的一个重要课题。酶工程就是将酶、细胞或细胞器等置于特定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。酶工程的核心问题是如何廉价且有效地生产出所需规格的酶，以及如何有效地通过化学或生物手段改造酶，并使之有效发挥催化特性，*大限度服务于人类。其内容包括：酶的生产（发酵工程和分离工程）、酶的改造（化学酶工程和生物酶工程，其中酶和细胞的固定化技术属于化学修饰范畴）、酶的应用（非水相酶学、酶反应器、酶传感器、酶抑制剂及酶的应用）。 早在19世纪初，已开展酶的提取和应用.工作。1833年，佩恩(Paven)从麦芽获得了棉布退浆酶；1874年，汉森(Hansen)利用牛胃凝乳酶生产奶酪；1908年，罗姆(Rohm)利用动物胰腺提取物软化皮革；1911年，华勒斯坦(Wallerstein)利用木瓜蛋白酶澄清啤酒。以上酶制剂早期应用简史告诉我们，酶制剂的生产一直停留在从动植物组织或细胞中提取酶的生产工艺。这种生产方式不仅工艺比较落后，