牡丹复色花瓣显色机理研究

第1章绪论/001
1.1植物花色与花青苷/003
1.1.1植物花色的形成机理/003
1.1.2花青苷的结构与种类/004
1.1.3花青苷的理化性质/005
1.1.4花青苷的生理和生物功能/005
1.2花青苷的生物合成及基因调控/006
1.2.1花青苷的生物合成途径/006
1.2.2花青苷合成的关键结构基因/007
1.2.3调控花青苷合成的相关转录因子/012
1.2.4与花青苷合成调控相关的miRNA/014
1.3RNA-seq技术/017
1.4植物复色花显色机理的研究进展/018
1.5牡丹花色形成及差异机理的研究进展/022

第2章牡丹复色花瓣显色生理机理研究/027
2.1牡丹复色花瓣的花色指数/028
2.1.1花色指数的测试方法/028
2.1.2花色指数的测定分析/028
2.2牡丹复色花瓣中的可溶性糖含量/028
2.2.1可溶性糖含量的测试方法/028
2.2.2可溶性糖含量的测定分析/029
2.3牡丹复色花瓣中的液泡pH值/030
2.3.1液泡pH值的测试方法/030
2.3.2液泡pH值的测定分析/030
2.4牡丹复色花瓣中的金属元素含量/031
2.4.1金属元素含量的测试方法/031
2.4.2金属元素含量的测定分析/031
2.5牡丹复色花瓣中的花青苷组成和含量/033
2.5.1花青苷组成和含量的测试方法/033
2.5.2花青苷组成和含量的测定分析/033
2.6牡丹复色花瓣中的黄酮、黄酮醇组成和含量/035
2.6.1黄酮、黄酮醇组成和含量的测试方法/035
2.6.2黄酮、黄酮醇组成和含量的测定分析/036
2.7牡丹复色花瓣的上表皮细胞形状/037
2.7.1上表皮细胞形状的测试方法/037
2.7.2上表皮细胞形状的观察分析/038
2.8牡丹复色花瓣的花色与主要生理指标的相关性分析/038

第3章牡丹复色花瓣显色分子机理研究/041
3.1牡丹复色花瓣的转录组测序（mRNA-seq）/042
3.1.1转录组测序所用总RNA的提取/042
3.1.2转录组测序与De novo组装/044
3.1.3unigene的功能注释与分类/046
3.1.4差异表达基因的分析/051
3.1.5牡丹花瓣复色形成相关基因的荧光定量PCR（qRT-PCR）验证/054
3.2牡丹复色花瓣显色相关关键结构基因PsDFR的克隆及序列分析/057
3.2.1牡丹复色花瓣中PsDFR基因cDNA全长的克隆/058
3.2.2牡丹复色花瓣中PsDFR基因组DNA全长的克隆/062
3.2.3牡丹复色花瓣中PsDFR启动子区域的克隆/065
3.2.4牡丹复色花瓣中PsDFR启动子区域甲基化水平的测定/070
3.3牡丹复色花瓣的小RNA测序（sRNA-seq）/072
3.3.1小RNA测序所用总RNA的提取/072
3.3.2小RNA文库构建和测序/074
3.3.3牡丹复色花瓣中miRNA的鉴定及靶基因的预测/076
3.3.4miRNA的差异表达分析/078
3.3.5差异表达miRNA靶基因的功能富集/078
3.3.6牡丹花瓣复色形成相关的差异表达miRNA/081
3.3.7牡丹复色花瓣小RNA测序结果的荧光定量PCR（qRT-PCR）验证/081
3.4牡丹花瓣复色形成相关的关键转录因子的筛选/083
3.4.1MYB家族相关转录因子的筛选/083
3.4.2bHLH家族相关转录因子的筛选/085
3.4.3WD40和SPL家族相关转录因子的筛选/085
3.5牡丹PsMYB114L和PsMYB12L基因的克隆及功能验证/087
3.5.1牡丹PsMYB114L和PsMYB12L基因全长的克隆/087
3.5.2牡丹PsMYB114L和PsMYB12L蛋白的生物信息学分析/088
3.5.3牡丹PsMYB114L和PsMYB12L基因的时空表达模式分析/094
3.5.4牡丹PsMYB114L和PsMYB12L蛋白的亚细胞定位/095
3.5.5牡丹PsMYB114L和PsMYB12L基因在拟南芥中的功能验证/099
3.5.6牡丹PsMYB114L和PsMYB12L基因在苹果愈伤组织中的功能验证/107
3.6牡丹PsMYB114L、PsMYB12L对PsDFR基因启动子结合和转录活性的验证/112
3.6.1牡丹PsMYB114L、PsMYB12L与PsDFR启动子结合的酵母单杂交验证/112
3.6.2牡丹PsMYB114L、PsMYB12L对PsDFR启动子激活的双荧光素酶报告验证/115

第4章牡丹复色花瓣显色机理初步解析/119
4.1牡丹复色花瓣显色相关的关键生理原因/120
4.2牡丹花瓣复色形成相关的关键基因的初步确定/121
4.2.1基于转录组测序筛选与牡丹花瓣复色形成相关的差异表达基因/121
4.2.2牡丹花瓣复色形成相关的关键结构基因的初步确定/122
4.2.3牡丹复色花瓣中关键结构基因PsDFR的克隆和序列比对/123
4.2.4基于小RNA测序筛选与牡丹花瓣复色形成相关的差异表达miRNA/124
4.2.5牡丹花瓣复色形成相关的关键转录因子的初步确定/126
4.3牡丹花瓣复色形成相关的关键基因的功能研究/127
4.3.1牡丹关键转录因子PsMYB114L和PsMYB12L的克隆及过表达/127
4.3.2牡丹PsMYB114L、PsMYB12L对PsDFR基因调控的验证/130

附录本研究相关基因的引物序列/131

参考文献/138