细胞生物学实验教程(第2版生命科学专业6+X简明教程系列配套实验教材)

**篇基础性实验 **章光学显微镜及其制片技术 实验一普通光学显微镜的使用与显微测量 【实验目的】 1.熟悉普通光学显微镜的主要构造及其性能。 2.熟练掌握光学显微镜的使用方法。 3.掌握显微测量的方法 【实验原理】 一、普通光学显微镜的成像原理 现代普通光学显微镜（optical microscope）利用凸透镜成像原理获得所观察样品的放大影像。其核心成像部件为两组凸透镜（物镜、目镜），成像原理如图1-1所示。 图1-1光学显微镜成像原理 将标本置于物镜一侧1～2倍焦距之间，通过物镜可在其另一侧成一反方向放大实像，放大倍数为物镜放大倍数，此实像位于目镜焦距之内，人眼通过目镜观察此放大实像，可看到一个和标本成反方向的放大虚像，总放大倍数是物镜和目镜放大倍数的乘积。 二、普通光学显微镜的主要结构 普通光学显微镜结构见图1-2，一般包括机械部分、光学放大部分和照明部分。 1.机械部分 （1）镜座：显微镜底座，支撑整个镜体。 （2）镜柱：镜座上面直立部分，连接镜座和镜臂。 （3）镜臂：连接镜筒和镜柱的弯曲构造，是取放显微镜的手握部位。 （4）镜筒：镜筒上端连接目镜，下端连接物镜转换器。现代光学显微镜的镜筒为倾斜式双目镜筒，目镜端倾斜45°，利于观察。双目镜筒设计时为适应不同人的瞳距，添加调节两目镜间距离装置，称瞳距调节器。为了补偿两眼的屈光度差别，至少一个目镜基座上带有屈光度调节旋钮。带有摄影功能的显微镜的镜筒为三目镜筒，其中一目通向摄影装置。镜筒内有复杂的折光和分光棱镜，确保光线可弯折并分配到指定的目镜。三目镜筒一般会有分光棱镜拉杆，拉到不同位置时，光线会分配到不同的目镜。 （5）物镜转换器：镜筒下方可左右自由旋转的圆盘，上有多个安装物镜的圆孔，用以安装不同的物镜。转动物镜转换器，当听到叩碰声时正下方的物镜恰好对准通光孔。 （6）载物台：物镜转换器下方的平台，可放置玻片标本。载物台上有标本夹以固定标本，通常会装有标本移动器，旋转标本移动器的两个旋钮可使标本夹前后或左右移动，利于快速并准确寻找目标。载物台中央开孔，称为通光孔，来自下方的照明光经此孔照射上来。 （7）调焦旋钮：依调焦方法的不同，显微镜可分为镜筒移动型和载物台移动型两种，现代显微镜一般为载物台移动型，其调焦旋钮在镜柱下端，顺时针或逆时针旋转调焦旋钮可使载物台上下移动。调焦旋钮有粗调焦旋钮和细调焦旋钮两种，粗调焦旋钮用于低倍镜观察时快速移动载物台，细调焦旋钮用于高倍镜观察时精细调焦。 部分种类的显微镜的粗调焦旋钮和细调焦旋钮同轴，粗调焦旋钮靠近镜柱。调焦装置有预调焦限位开关，用于限定粗调焦旋钮调节载物台上升时的*高位置。一般将此位置设定为稍高于聚焦位置，这样可快速转动粗调焦旋钮上升到此处，再缓慢下降，即可快速到达调焦位置。 2.光学放大部分 （1）物镜：安装在物镜转换器上，是显微镜*主要的光学部件。物镜常用的放大倍数有4×、10×、40×、100×等。一般称40×及以上倍数为高倍镜，有些倍数较高的高倍镜在使用时要在镜头前端和标本间充满高折射率的油，此种物镜称油浸物镜，简称油镜。 在聚焦情况下，物镜前端和样品间的距离称工作距离（working distance），物镜后端定位面和样品间的距离称齐焦距离（parfocal distance）。物镜放大倍数越大，焦距越短，工作距离越短。接在一个显微镜上的不同物镜，其齐焦距离*好相同，聚焦后，换另一物镜观察时，仅通过细调焦旋钮微调即可聚焦。图1-3显示了不同放大倍数的物镜的工作距离、齐焦距离以及表面标识的性能参数，其中*重要的参数是数值孔径，其数值决定了所观察图像的分辨率。油镜上会有“油”“Oil”等标识。 图1-3物镜的主要性能参数及工作距离、齐焦距离 （2）目镜：安装在镜筒的上端，放大倍数为5×、10×、15×等。常用的为10×。在目镜内，有一金属环，其大小决定了视野的*大范围。在物镜聚焦的状态下，样品通过物镜所成放大实像正好位于金属环处，如果在此放置一个带有等间距刻度线的透明玻璃片（目镜测微尺），能同时看清刻度线和样品像，从而可对样品像进行相对测量。 3.照明部分 照明部分主要包括光源和照明光路两部分，现代显微镜大都采用电光源照明。照明光路有临界照明、散射光照明和科勒照明3种（图1-4）。 图1-43种照明方式光路简图 （1）临界照明：此种照明光路系统包括凸透镜、聚光器（含聚光器透镜和聚光器光阑），调整聚光器高度，使灯丝通过凸透镜和聚光器透镜成像于载玻片的样品处，这样可提高样品处的光亮度。早期的电光源亮度低，为了提高照明亮度，显微镜多采用临界照明方式，但是临界照明方式的缺点是照明不均匀，样品处温度较高。 （2）科勒照明：此种照明光路系统包括凸透镜（多组）、光源视场光阑、聚光器。调整聚光器高度，使光源视场光阑经聚光器透镜成像于载玻片的样品处，此时灯丝像成像于聚光器光阑处，这样可使样品处的照明均匀，亮度较高且不至于温度过高。调节光源视场光阑和聚光器对中旋钮，使其在载玻片处的像正好外切目镜的观察视野。科勒照明方式大多用于对性能要求较高的研究级显微镜中。 （3）散射光照明：此种照明光路系统包括毛玻璃、聚光器。由光源发出的光经毛玻璃变为散射光，散射光经聚光器会聚后再照射到样品上，照明均匀，但是亮度较科勒照明低一些，一些对性能要求较低的教学级别显微镜采取了此种照明方式。 照明光路中的聚光器：以上3种照明方式的照明光路中，均采用了聚光器，其位于载物台的通光孔下方，由聚光器透镜和聚光器光阑组成。在散射光照明方式中聚光器的高度越高，照明范围越小，亮度越低。而临界照明和科勒照明方式中聚光器高度必须调整到特定位置。聚光器光阑的大小主要影响成像的分辨率、对比度和景深范围，*好不要用其来调节照明亮度。 三、显微镜使用中的一些重要参数及术语 1.数值孔径和分辨率 数值孔径（numerical aperture，NA）是物镜和聚光器的重要参数，其值为nsinθ，其中n为透镜要求介质的折射率，大部分透镜要求介质为空气，折射率为1，油镜所需介质物镜油的折射率在1.5左右。θ为聚焦时透镜边缘到样品视野中央点的夹角一半（图1-3）。一个物镜一旦制作完成，其数值孔径就是一个固定值，一般会标识在其放大倍数之后。 具有可变光阑的聚光器的数值孔径随光阑开口大小变化而变，可变光阑开口越大，θ越大，数值孔径值越大。多数可变光阑聚光器上标有数值孔径值刻度或物镜的放大倍数标识，用以指示光阑开口大小。 分辨率（分辨力、分辨本领，resolution）是成像系统能分辨出的两点间的*小距离。显微镜的分辨率计算公式为D=0.61λ/NA物镜，其中，λ为照明光的波长，λ越小，物镜NA值越大。D值越小，分辨率越高。现代普通光学显微镜的物镜NA极限值为1.3左右，λ选紫色可见光450nm，计算可得D值约为0.2μm。这是普通光学显微镜的*大分辨率（选用NA值*高的物镜）。 考虑到聚光器数值孔径因素，显微镜的分辨率公式为D=0.61λ/（1/2NA物镜＋1/2NA聚光器），当物镜一定时，显微镜影像的实际分辨率还受聚光器的NA值影响，聚光器光阑越大，NA值越大，分辨率越高。但是聚光器的NA值变大后，照射到样品上的杂散光变多，使成像反差变小，综合考虑反差和分辨率因素，聚光器的NA值一般情况下调节到物镜NA值的0.7倍为宜。 2.明视距离和放大倍数 明视距离是指人眼在一般照明下习惯的观察距离，为250mm。人眼的分辨率是指在明视距离下能够分辨的两点间*小距离，据测定约为0.2mm。在明视距离下，物镜和目镜的放大倍数是其标称放大倍数。显微镜的放大倍数为物镜标称放大倍数和目镜放大倍数的乘积。此放大倍数是长度比，不是面积比。 放大后的影像分辨率刚好等于人眼分辨率，此时的放大倍数为有效放大倍数。用NA值为1.25的100×物镜观察样品，样品初始分辨率为0.2μm，经100倍放大后影像分辨率变为20μm，再经10×目镜放大后，分辨率变为200μm，等于人眼分辨率，此时的总放大倍数1000倍为有效放大倍数，如果用20×目镜，分辨率变为400μm，大于人眼分辨率，2000倍放大倍数中的部分放大属无效放大。 3.孔径光阑和视场光阑 光阑是指光学系统中能限制成像光束的光孔和成像元件（如透镜、棱镜等）的边框，可以改变孔径的光阑称为可变光阑。依光阑在光学系统中的作用，其主要分为孔径光阑和视场光阑。 孔径光阑限制了成像光束的立体角，决定了轴上点成像光束中*边缘光线的倾斜角。孔径光阑口径的大小将影响分辨率、像面照度。光学显微镜中的孔径光阑是聚光器光阑。视场光阑是限制样品能被系统成像的*大范围的光阑，它决定了光学系统的视场大小。光学显微镜中的视场光阑在目镜中。 在科勒照明方式的光路中，光源端有一可变光阑，常被称为视场光阑，但是其并不是严格意义的视场光阑。由于这一光阑通过聚光器透镜成像在样品处，所以这一光阑的大小实际上是决定了样品被照亮的范围，并不限定成像范围。 4.焦点深度 焦点深度，简称焦深。从直观角度讲，使用显微镜时，当聚焦到目标后，不仅位于该目标所在平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内的点，也能看得较为清楚，这个较为清楚部分的上下范围就是焦深。 在4×物镜下微调细调焦旋钮时，看到的影像变化不大，而在40×物镜下，则变化很大，这是因为放大倍数越大，焦深越小。 除放大倍数影响焦深外，聚光器光阑也影响焦深，聚光器光阑开口越大，焦深越小。 四、显微测量原理 对显微镜下的样品进行长度测量，*直接的办法是用一个刻有标准长度间隔刻度线的标准尺玻片和样品玻片重叠，在视野里同时看到标准尺和样品后，移动标准尺进行直接测量。但是由于盖玻片的存在，标准尺和样品无法紧贴，在高倍镜下无法同时聚焦，而且高倍镜工作距离很短，有时很难同时容纳标本玻片和标准尺玻片，所以这种直接测量法很少使用。 另一种方法是间接测量法。间接法测量时测微尺置于目镜的视场光阑处，与样品经物镜后所成的中间像重叠，在目镜中可同时看清测微尺刻度线和标本像，测量后，用测微尺测量的长度除以物镜放大倍数，即实际长度。由于物镜放大倍数数值并非精确值，所以此种方法测得长度精度较小。 为了提高精度，可将另一标准尺置于载物台上，聚焦后，用载物台上的标准尺测量目镜测微尺刻度，计算得出目镜测微尺邻近刻度线间隔对应的长度L。再用目镜测微尺在相同物镜下测量标本，读取的刻度数乘以L即可得出标本实际长度。不同物镜，有不同的L值。 L的计算方法为：选取一个物镜，调焦，在目镜中同时清晰地看到标准尺刻度线和目镜测微尺刻度线，移动载物台，转动目镜，将测微尺的一侧刻度线和标准尺一个刻度线重合，再向另一侧寻找较远的两个刻度线重合的位置，记下标准尺和目镜测微尺上两个重叠刻度线间的格数，分别记作A（标准尺格数）和B（测微尺格数）。测微尺在此物镜