现代生命科学仪器设备与应用

**篇 生物显微技术与仪器设备 概述 生物显微技术是利用显微镜观测微小生物的表观形态、细微结构，完成显微操作的一系列方法和手段。包括显微镜应用，样本制备，成像观测，影像解析与数据分析等。 显微镜总体分为两类：光学显微镜和电子显微镜。前者以光波为光源，经过一系列透镜放大成像。生物学常用光学显微镜有两类。 （1）可见光源显微镜：普通生物显微镜、体视显微镜、倒置显微镜、微分干涉相差显微镜。 （2）紫外光源显微镜：荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、超高分辨率显微镜。 光学显微镜借助荧光标记技术拓展了生物学应用，成像更清晰，影像分辨率提高。 电子显微镜是以电子束为光源，电磁场作透镜的高分辨显微设备。当电子束照射样本时产生：透射电子、透过散射电子、二次电子、背散射电子、吸收电子、特征X射线、俄歇电子、阴极荧光等信号。根据所用电子信号的不同，电子显微镜分为：透射电子显微镜、扫描电子显微镜、电子探针显微分析仪等。其放大倍数可至几百万倍，分辨率比光学显微镜高出一千多倍，达到0.2nm或更低。常用显微镜的特点与应用见常用显微镜的特点与应用表。 常用显微镜的特点与应用表 本篇**章至第四章分别介绍荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、电子显微镜（透射电子显微镜、扫描电子显微镜、扫描隧道显微镜、原子力显微镜）、显微制样装备与技术，以及这些设备的功能原理、科研应用、仪器操作、维护保养等。 **章 荧光显微镜 荧光是无色温冷光，当电子受激跃迁返回低能态时所发出的光，波长为400～800nm的可见光（蓝、绿、黄、红），灵敏度高，选择性强。它有两种类型：①自发荧光，紫外光照射即发出荧光，如叶绿素、血红素等，也称固有荧光；②继发荧光，荧光素染色后受紫外光激发而发射出的荧光，常称为光化荧光。 **节 荧光显微镜介绍 荧光显微镜（fluorescence microscope，FM）由光学显微镜和荧光装置组合而成，常用的有正置荧光、倒置荧光、体视荧光显微镜三种类型。荧光装置是紫外光激发荧光素发射荧光的系统，由紫外光源、滤光片组件、二向色镜等光学组件精密组装而成。正置荧光显微镜*为普及（图1-1），分落射式、透射式两种。 一、正置荧光显微镜 （一）落射式荧光显微镜 1.成像过程 紫外光从显微镜后上方穿过激发滤光片，遇二向色镜转向90°向下穿过物镜聚光后落射在样本上，荧光物质受到激发而发射出荧光反向穿过物镜、二向色镜、发射（阻挡）滤光片，至目镜二次成像（图1-2）。二向色镜具有反射紫外光，通透荧光的特性。 图1-1 正置荧光显微镜 图1-2 落射式荧光显微镜光路图 图1-3 透射式荧光显微镜光路图 2.设备特点 落射式荧光显微镜可观测所有类型的切片样本。对样本厚度、颜色、背景要求宽松，成像质量高，图像效果好，适应面广，光毒害小。物镜具有聚光镜的作用，操作简便。从低倍到高倍整个视场照明均匀，影像清晰。但制造成本较高，价格较贵，为高档研究级显微镜。 （二）透射式荧光显微镜 1.成像过程 紫外光从样本下方经过激发滤光片、反光镜后转向通过暗视野聚光镜，穿透照射切片样本，样本荧光素受到激发发射荧光，荧光通过物镜、发射（阻挡）滤光片至目镜成像（图1-3）。 2.设备特点 透明度不好的切片样本不适合使用。低倍镜下影像明亮，但照明范围不易确定；高倍镜下影像较为暗淡，光源调焦不易控制。优点是结构简单，造价便宜，对于固定用途或实验教学有成本优势。 二、多功能荧光显微镜的应用 荧光显微镜具有高灵敏、高分辨、低光毒，对活细胞刺激小，多重染色观测方便的优势，是观测荧光目标物结构、形态、吸收、运输、定性、定量、分布、定位、示踪、鉴定等影像结果的重要设备，多功能荧光显微镜的应用更加广泛。 （一）荧光观测 1.单色荧光观测 在相应波长的滤光片（蓝、绿、黄、红等）下观测、寻找、示踪荧光目标物（亚细胞器、DNA、RNA、活性蛋白质等）的结构形态、空间分布、荧光强度、光亮变化等。 2.多色荧光观测 在同一视野下观测多张不同颜色的荧光影像，叠加合成为一张多色荧光图像，便于比较、发现更多的目标物，以及相互间的关联与作用。 3.免疫荧光观测 荧光素标记的抗体（或抗原）与样本（细胞、组织、分离物等）中相应的抗原（或抗体）结合制样，观测成像。这种免疫荧光观测有两种类型。 （1）直接免疫荧光（DIT）：将抗体（抗原）与荧光素连接，观测相应的抗原（抗体）。 （2）间接免疫荧光（IIT）：用荧光素标记第二、第三抗体观测相应抗原抗体复合物。 4.荧光-明视场连用观测 弱荧光信号的样品先观测荧光成像，再改用明视场观测，对比同一视野下的影像，筛选具有荧光特质的目标物。荧光-明视场连用技术在病理切片、荧光观测等相关研究中常用。优点：对比观测、视野明亮、影像均匀、操作简便。缺点：透明样本对比度低，立体感差。 （二）微分干涉相差观测 微分干涉相差（differential interference contrast，DIC）成像，是明场条件下辨析同平面细微差异的观测方法。利用偏振光的光程差调节使标本的细微结构呈现正或负的投影影像，形成立体浮雕般的成像效果。适用于透明样本，捕捉细节变化（图1-4）。 图1-4 相差显微影像 左：相差影像；右：DIC影像 （三）明视场观测 明视场观测是生物显微成像中的常用方法，在多功能荧光显微镜中其技术配置更为精良，成像效果也有所改善，它既是荧光观测过程的一个环节，又可单独观测非荧光物质。荧光显微镜中有紫外、可见两套光源，明视场成像使用可见光源，技术方法、使用步骤与普通生物显微镜一样。 第二节 荧光显微镜的科研应用 一、细胞物质观测 （一）细胞结构及目标物观测 荧光有两个特点：①灵敏度高，是可见光的100倍；②选择性强，激发光、发射光双重选择。所以，目标物成像干扰少。适合的荧光素染色后，即可观测目标物（细胞器、结构性蛋白、DNA、RNA、酶、受体分子）的结构、形态、组成、分布、含量、轨迹等荧光影像，通过影像学分析判断其性质、位置、数量等信息。 （二）细胞内钙离子信号观测 钙离子维持着细胞膜两侧的生物电位、信号传导、激素调节，并深度参与生理活动。所以，钙离子信号有增减、波动、传递的动态变化，我们只要观测细胞内钙离子的浓度与分布，便可以解析其功能与作用。Fluo-3是标记钙离子的荧光探针，属极性化合物，较难渗入细胞。而Fluo-3AM（Fluo-3的乙酰氧基甲酯衍生物）改善了渗透性、稳定性，但自身荧光变弱。实验中先利用其优点与细胞孵育渗入，后被酯酶水解成Fluo-3，再与钙离子结合产生明亮荧光。 1.荧光标记 用0.5～5μmol/L Fluo-3AM与细胞在20～37°C孵育15～60min进行荧光探针装载。洗涤之后可再孵育20～30min，确保Fluo-3AM在细胞内完全转变成Fluo-3，细胞悬浮液观测备用。［5mmol/L Fluo-3AM储备液由二甲基亚砜（DMSO）配制后备用。］ 2.荧光观测 探针Fluo-3激发波长506nm，发射波长526nm。选用波长接近的滤光片观测，影像拍照，软件分析。若绘图记录，光强标注：“-”无荧光或微弱，“+”明确可见，“++”明亮，“+++”耀眼。 3.钙离子荧光探针的类型 （1）可见光激发的：如Fluo-3（506nm/526nm）、Fluo-4（494nm/516nm）、Rhod-2（549nm/578nm）。 （2）紫外光激发的：如Fura-2（340nm，380nm/510nm）、Indo-1（355nm/400nm，475nm）。 （3）功能辅助增强剂：如Pluronic F-127（探针加载增强剂）、Ionomycin（钙离子载体）、BAPTA（钙螯合剂）等，根据需要配合使用。 钙离子的浓度观测除了用荧光显微镜之外，还可用酶标仪、激光扫描共聚焦显微镜、流式细胞仪等。 二、荧光示踪观测 细胞活动示踪、表达蛋白标记、基因组学蛋白质组学研究都离不开荧光标记。绿色荧光蛋白（GFP）分子质量小，溶解性好，无毒副作用，常作为荧光探针，其表达产物经蓝光激发便可发射绿色荧光。 （一）靶基因分子标记示踪 将目标基因与标签蛋白（GFP）基因构成融合基因，转入细胞进行表达，表达产物细胞中的标签蛋白质具备荧光特性，便于活体观测，筛查跟踪。 （二）信号分子迁移路径示踪 利用GFP与信号分子的偶联，观测信号传导过程的路径与分布，探讨信号分子迁移的动力、规律和作用，在生物生理学、药理学的研究中，以及药物筛选与药效评价中经常使用。 三、免疫荧光法观测 免疫荧光法有两种：①荧光抗体法，用荧光抗体示踪或检测相应的抗原；②荧光抗原法，用已知的荧光抗原标记物示踪或检测相应的抗体。利用抗原抗体特异性结合与荧光标记技术联用，观测结合对象的方法称为免疫荧光技术。通过标记抗体，可观测激素、蛋白质、酶、药物、病毒等相应抗原的荧光影像，以及在细胞中的含量、分布与位置。 （一）直接免疫荧光法观测 荧光抗体法较为常用。标记过的荧光抗体直接加在抗原样本上，经过一定温度、时间的染色，洗去未参加反应的荧光抗体，晾干封片即可观测。 （二）间接免疫荧光法观测 对于未知抗原，先用已知未标记荧光的**抗体与抗原样本反应，洗去未反应的抗体，再用标记荧光的第二抗体与抗原样本反应，使之成为抗原-抗体1-抗体2的复合物，再洗去多余的标记抗体，晾干封片，荧光观测。 对于未知抗体，抗原样本应为已知，待检样本为**抗体，方法步骤与上述操作相似。 免疫荧光常用标记物有异硫氰酸荧光素（FITC，绿色荧光）、罗丹明（TRITC，黄色荧光）、四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC，黄色荧光）、Cy3（黄色荧光）、Cy5（红色荧光）、德克萨斯红（Texas Red，橙色荧光）等。