生物化学与分子生物学实验 第2版

实验室总则 一、实验特点 生物化学与分子生物学是一门重要的实验性基础学科，其理论与实验技术相辅相成，在整个生物化学及相关学科的发展上，都起着决定性的作用。生物化学与分子生物学实验是实验性科学的重要组成，归纳起来，有如下特点： （1）生物化学与分子生物学实验与其他学科互相渗透，在渗入其他学科的同时，也渗进相关学科的理论知识和实验方法。 （2）微量和定量是一大特点，因此要求有严格的条件，实验者必须有严谨的实验态度。 （3）实验涉及生物大分子和生物材料的检测。 （4）新技术手段的不断涌现，使生物化学与分子生物学实验方法不断发展，并得到广泛的应用，推动生物化学与分子生物学理论的发展。 （5）与临床密切联系，为临床检测提供实验技术手段。 二、实验须知 （1）生物化学与分子生物学实验有着独特的实验技能和基本操作。学生应本着认真、积极的态度，在教师的指导下，完成每次实验。不仅要明白实验的原理、步骤和关键所在，还要能发现问题，积累经验，并对实验结果展开讨论。 （2）课前认真预习，实验过程中，严格遵守操作规范。实验结果和数据应如实、及时记录，并当场写出实验记录，经教师检查同意并签字后，方可离开。实验报告应在实验后一天内完成并交到指定地点。 （3）遵守课堂纪律，不得迟到早退，实验室内不得吸烟、饮食、大声喧哗，学生之间应互助友爱。 （4）爱护实验器材。在了解仪器性能和操作规程之前，不得冒然使用，更不可擅自拆卸或将部件带出室外。实验过程中，如发现仪器损坏或运转异常，应立即妥善处理。 （5）注意安全。对腐蚀性试剂或易燃有机溶剂的操作应格外小心；水电煤气在停用时应及时关闭。 （6）保持室内整洁，公用试剂用毕应立即盖好，放回原处，实验中应注意节约。 （7）学生应轮流值日，负责实验室的卫生和安全，并协助教师从事一些实验前的准备工作。 三、实验记录及实验报告的书写 生物化学与分子生物学实验是生物化学与分子生物学及其他生物学科的重要研究手段，是在生物化学与分子生物学理论及其他相关理论指导下的实践。经过实践，掌握科学观察的基本方法和技能；培养科学思维、分析判断及解决问题的能力；培养实事求是的工作作风。为达到实验目的，要求在实验中严肃认真地进行操作，细致观察各种变化并如实做好实验结果的记录，要求在操作结束后认真进行计算或分析，写好实验报告。 （一）实验记录 实验记录是指在实验中将观察到的现象、结果、数据及时、准确、如实、详尽、清楚地记录在记录本上。实验结果的记录不可掺杂任何主观因素，不能受现成资料及他人实验结果的影响，若出现“不正常”的现象，更应如实详尽记录。 完整的实验记录应包括日期、题目（内容）、现象及结果，使用精密仪器进行实验时还应记录仪器的型号及编号。一般采用表格式的记录方式，简练而清楚，不提倡使用易于涂改及消退的笔做原始记录。 （二）实验报告 实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。完整的实验报告应包括实验名称、日期、目的要求、实验原理、操作方法、试剂、仪器设备、实验结果、讨论等内容。其中目的要求、原理、操作方法、试剂、设备等项目只要求进行简明扼要的叙述，不应将讲义内容原版抄录一遍，但对实验的条件、操作要点等实验成败的关键环节应做描述。 实验结果应如实记录实验中观察到的现象及各种原始数据，要求记录数据的计算过程及计算结果，包括根据实验数据及计算做出的各种图表（如曲线图、对照表等）。 讨论部分不是对结果的重述，而是对实验结果、方法和异常现象进行的探讨和评论，以及对实验设计的认识、体会及建议。一般要有实验结论，简单扼要的说明本次实验所获得的结果。 四、安全措施 （1）进入实验室必须穿实验工作服。 （2）实验室内严禁吸烟，易燃易爆物品应远离火源。低沸点的有机溶剂不得在火焰上直接加热；必须加热时，可在水浴进行。 （3）使用电器设备要严防触电。切忌用湿手触摸电器。发现仪器漏电时，立即报告并停止使用。一旦发生触电事故，应立即关闭电源，并用干木棍将导线挑离被电者身体；对呼吸停止者，应立即进行人工呼吸，并及时送医院抢救。 （4）强酸、强碱液体或剧毒液体，不得用口经吸量管吸取，必须使用吸耳球，如不慎吸入口内或沾及皮肤，应立即用清水多次漱口或局部冲洗。若为强碱灼伤，清洗后可用5%硼酸溶液清洗；若为强酸灼伤，水洗后可用5%碳酸氢钠溶液清洗。严重灼伤者，应立即将残留在身体上的液体轻轻冲洗后，送医务部门处理。 （5）用后的浓酸、浓碱残液，应倒入指定的容器。不要直接倒入水池内，以免蚀损水管；若少量残液已倒入池内，应立即放水稀释冲走。 （6）有毒试剂应集中处理，实验动物尸体不得随意丢弃，应集中统一处理在实验过程中要注意生物安全问题。 （7）万一着火，不要惊慌失措，要立即切断火源和电源，移走易燃物品，同时立即报告指导老师进行紧急处理，严防火势蔓延；若火势蔓延，应立即报警。万一衣服着火，切忌惊慌奔跑，可用衣服包裹身体或就地翻滚，借以绝氧灭火。 **篇 基础性实验 **章 生物化学与分子生物学实验基本操作 一、玻璃器皿的洗涤与干燥 生物化学与分子生物学实验常用各种玻璃仪器，其清洁程度直接影响实验结果的准确性。因此，清洁玻璃仪器不仅是实验前后的常规工作，也是一项重要的技术性工作。清洗玻璃仪器的方法很多，需根据实验要求、污物的性质和沾污程度选用合适的清洁方法。 （一）玻璃器皿的洗涤 1．新购玻璃仪器的清洗 新购玻璃仪器，其表面附有碱质，可先用肥皂水刷洗，再用流水冲净，浸泡于1%~2%盐酸中过夜，再用流水冲洗，*后用蒸馏水冲洗2~3次，干燥备用。 2．使用过的玻璃仪器的清洗 （1）一般玻璃仪器：如试管、烧杯、锥形瓶等，先用自来水刷洗后，再用肥皂水或去污粉刷洗，然后用自来水反复冲洗，去尽肥皂水或去污粉，*后用蒸馏水淋洗2~3次，干燥备用。 （2）容量分析仪器：如吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自来水冲洗，待晾干后，再用铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水充分冲洗，*后用蒸馏水淋洗2~3次。干燥备用。 （3）比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗。洗不净时，用盐酸或适当溶剂冲洗，再用自来水冲洗。避免用碱液或强氧化剂清洗，切忌用试管刷或粗糙布（纸）擦拭。 （二）玻璃器皿的干燥上述所有玻璃器皿洗净（以倒置后器壁不挂水珠为干净的标准）后，根据需要晾干或烘干。 1．晾干 不急用的玻璃仪器洗净后，可沥尽水分，倒置于无尘的干燥处，让其自然风干。 2．加热烘干 一般玻璃仪器洗净并沥尽水分后，可置于电烘箱中烘烤，温度控制在105~110℃，烘1小时左右。但带有刻度的量器不宜在高温下烘烤。有盖（塞）的玻璃仪器，如容量瓶、称量瓶等，应去盖（塞）后烘烤。 二、移液器的使用 （一）刻度吸量管的使用方法 刻度吸量管的规格有0.1ml、0.2ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml及10ml等，供量取10ml及以下任意体积的液体用。 1．执管 将中指和拇指拿住吸量管上口以示指控制流速；刻度数字应朝向操作者。 2．取液 把吸量管插入液体内（切忌悬空，以免液体吸入洗耳球内），用洗耳球吸取液体至所取液量的刻度上端1~2cm处，然后迅速用示指按紧吸量管上口，使管内液体不再流出。 3．调准刻度 将含有充足液体的吸量管提出液面，用滤纸片抹干管尖外壁液体，然后垂直提起吸量管于供器内口（管尖悬离供器内液面）。用示指控制流至所需刻度，此时液体凹面、视线和刻度应在同一水平面上，并立即按紧吸量管上口。 4．放液 放松示指，让液体自然流入受器内（如移液管标有“吹”字，则应将管口残余液滴吹入受器内）。此时，管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体中，以免污染吸量管及试剂。 5．洗涤 吸取血液、尿、组织样品及黏稠试剂的吸量管，用后应及时用自来水冲冼干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，待实验完毕后，用自来水冲洗干净。晾干水分，再浸泡于铬酸洗液中，数小时后，再用流水冲净，*后用蒸馏水冲洗。晾干备用。 （二）枪式移液器的使用 枪式移液器的使用见图1-1-1。 （1）调体积，选取钮至所需值。 （2）套上枪头。 （3）垂直持握枪式移液器外壳，按下拇指至**挡。 （4）将枪头插入溶液，徐徐松开拇指，使其复原。 （5）排放时，重新将拇指按下，至**挡后，继续按至第二挡排空。 注意：移液过程应控制速度、力度。 图1-1-1 枪式移液器 1．液体吸收钮；2．体积选取钮；3．体积显示；4．枪头排放钮；5．枪头排放器；6．枪头接嘴 三、溶液的混匀 样品与试剂的混匀是保证化学反应充分进行的一种有效措施。为使反应体系内各物质迅速地互相接触，必须借助于外加的机械作用，混匀时须防止容器内液体溅出或被污染，严禁用手指直接堵塞试管口或锥形瓶口振荡。混匀的方式大致有下面几种，可随使用的器皿和液体容量而选用。 1．旋转混匀法 用手持容器，使溶液做离心旋转。该法适用于未盛满液体试管或小口器皿（如锥形瓶），旋转试管时宜用手腕旋转。 2．指弹混匀法 用于持容器，手腕用力前后摇动使内容物混匀。还可用左手持试管上端，用右手手指轻轻弹动试管下部，使管内溶液做旋涡运动；或用右手持试管上端，在左手掌上打击的方法混匀内容物。 3．颠倒混匀法 适用于有塞的容量瓶及有塞试管内容物的混匀。一般试管内容物混匀时可用聚乙烯等簿膜封口，再用手按住管口颠倒混匀。 4．吸量混匀法 用吸量管将溶液反复吸放数次，使溶液充分混匀。 5．玻棒搅动法 适用于烧杯、量筒内容物的混匀，如固体试剂的溶解和混匀。其他，还有电磁搅拌混匀法和振荡器混匀法等。 四、常用生物材料的处理 （一）抗凝全血的制备 全血是在取出的血液与适量的抗凝剂充分混合所得的抗凝血。保存时，应放入冰箱。 每毫升血液需加抗凝剂的量为：草酸钾或草酸钠1~2mg；枸橼酸钠5mg；肝素0.1~0.2mg。根据实验目的不同要对抗凝剂加以选择，如血糖定量可用氟化钠以防止糖的分解，*好与草酸盐并用；肝素抗凝效果好，适用于各种分析。 采血一般应在早晨空腹或禁食6小时以上安静条件下采血。避免因饮食及其他生理情况常使血液成分发生变动。主要途径有耳垂或指尖采毛细血管血（仅在用血量较少用）以及静脉采血。 （二）血清的制备 把新采的不加抗凝剂血于试管或离心管中，倾斜放置，任其自然凝固，然后移放冰箱或室温放置等待析出血清，移取血清于另外小试管中。保存时，应放入冰箱。 （三）血浆的制备 采血后经与抗凝剂混匀得到抗凝血液经离心（2000~3000r/min，5~10分钟），使有形成分下沉，上层即为血浆。注意吸取血浆，移放另外试管中备用。保存时，应放入冰箱。 注意：血液加入抗凝剂后，要及时轻轻摇动使抗凝剂溶解并混匀，不可强力振荡，避免溶血。 （四）无蛋白血滤液的制备 血液中所含的蛋白质，常影响其他成分的测定。故检测非蛋白质的各种成分时，须先将其中的蛋白质除去，制成无蛋白血滤液，再进行分析测定。常用的蛋白沉淀剂有三氯乙酸、钨酸、有机溶剂、中性盐等，血液中加入蛋白质沉淀剂后离心或过滤所得的上清液或滤液，即无蛋白血滤液。 除去蛋白质的方法可分成两类：一类是使蛋白质脱水沉淀，如有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮等）及中性盐[（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl等]沉淀法