基于环境DNA的生物多样性研究和监测

目录 第1章 环境DNA概述 1 1.1 概念 1 1.2 eDNA分析简史 2 1.3 eDNA技术的难点 4 1.4 eDNA研究的工作流程及其主要方法 4 1.5 eDNA的应用 6 第2章 DNA宏条形码选择和设计 8 2.1 选择哪种DNA宏条形码？ 8 2.2 理想DNA宏条形码的特性 9 2.3 in silico引物设计和测试 11 2.3.1 必要前提 12 2.3.2 参考序列：ecoPrimers的说明、筛选和格式设置 12 2.3.3 使用ecoPrimers进行in silico引物设计 13 2.3.4 使用ecoPCR进行in silico引物测试 16 2.4 DNA宏条形码引物对案例 21 第3章 参考数据库 26 3.1 从EMBL、GenBank和DDBJ中提取参考数据库 26 3.1.1 下载EMBL的本地副本 27 3.1.2 识别与相关宏条形码相对应的序列 28 3.2 特异性标记物的参考数据库 29 3.2.1 核rRNA基因参考数据库 29 3.2.2 真核生物特异性数据库 30 3.3 构建本地参考数据库 31 3.3.1 基于PCR的本地参考数据库 31 3.3.2 基于鸟枪法的本地参考数据库 33 3.4 当前的挑战和未来的方向 34 第4章 采样 35 4.1 eDNA的环境循环 35 4.1.1 状态和来源 35 4.1.2 归趋 36 4.1.3 迁移 37 4.2 采样设计 38 4.2.1 聚焦合适的DNA 39 4.2.2 确定采样方案 39 4.3 样品保存 41 第5章 DNA提取 43 5.1 土壤样品提取 44 5.2 沉积物样品提取 48 5.3 凋落物样品提取 48 5.4 粪便样品提取 48 5.5 水样提取 49 第6章 DNA的扩增和多重扩增 50 6.1 PCR的原理 50 6.2 选择哪种聚合酶？ 52 6.3 标准PCR反应 54 6.4 质控的重要性 55 6.4.1 提取中的阴性对照 55 6.4.2 PCR中的阴性对照 56 6.4.3 PCR中的阳性对照 56 6.4.4 标签系统对照 56 6.4.5 内参对照 57 6.5 PCR的优化 57 6.6 如何降低污染风险？ 60 6.7 阻滞寡核苷酸以减少非目标序列的扩增 61 6.8 做多少个PCR重复？ 62 6.9 同一个PCR中若干个宏条形码的多重扩增 63 6.10 在同一测序通道上多重扩增多个样品 63 6.10.1 问题概述 63 6.10.2 方案1：使用Illumina接头的单步PCR 65 6.10.3 方案2：使用Illumina接头的两步PCR 66 6.10.4 方案3：带有标记引物的单步PCR 67 第7章 DNA测序 70 7.1 一、二、三代测序技术概述 70 7.2 Illumina技术 71 7.2.1 文库制备 71 7.2.2 流动槽、桥式PCR和簇 73 7.2.3 合成测序 73 7.2.4 序列读长的质量分数 75 第8章 DNA宏条形码数据分析 80 8.1 基础序列处理和筛选 80 8.1.1 测序质量 80 8.1.2 双端读长配对 83 8.1.3 序列的分解使用 84 8.1.4 序列去重复化 85 8.1.5 序列初步筛选 85 8.2 序列分类 86 8.2.1 系统分类 87 8.2.2 无监督分类方法 89 8.2.3 嵌合体识别 91 8.3 利用实验对照的优势 92 8.3.1 筛除潜在污染 92 8.3.2 去除功能障碍的PCR 95 8.4 生态学分析的一般考量 96 8.4.1 采样尝试及其代表性 97 8.4.2 处理不同测序深度的样品 99 8.4.3 进一步调整生态学模型以适应宏条形码 100 第9章 单物种检测 102 9.1 定量PCR（qPCR）原理 103 9.1.1 通过荧光测量实时记录扩增子累积情况 103 9.1.2 典型扩增曲线 103 9.1.3 使用Ct方法量化目标序列 103 9.2 针对单物种的qPCR条形码的设计和测试 104 9.2.1 特异性问题 104 9.2.2 qPCR引物和探针 105 9.2.3 候选qPCR条形码 105 9.3 其他实验考虑 106 9.3.1 与采样、提取和PCR扩增相关的一般问题 106 9.3.2 特别关注污染和抑制 106 第10章 用于功能多样性的环境DNA 107 10.1 DNA宏条形码的功能多样性 107 10.1.1 功能推理 107 10.1.2 以活跃种群为目标 109 10.2 宏基因组学和宏转录组学：测序不仅仅是一个条形码 111 10.2.1 一般的采样限制 111 10.2.2 一般的分子约束 113 10.2.3 从序列到功能 114 第11 章一些早期的里程碑式研究 118 11.1 eDNA概念的提出以及关于微生物的初步结果 118 11.2 检验宏基因组以探索eDNA携带的功能信息 119 11.3 从微生物扩展到大型生物 120 第12章 淡水生态系统 123 12.1 淡水生态系统中eDNA的产生、持久性、迁移和可检测性 123 12.1.1 产生 123 12.1.2 持久性 124 12.1.3 迁移/扩散距离 124 12.1.4 可检测性 125 12.2 大型无脊椎动物 125 12.3 硅藻和微真核生物 126 12.4 水生植物 127 12.5 鱼类、两栖动物和其他脊椎动物 127 12.5.1 物种检测 127 12.5.2 生物量估算 128 12.6 河流是否是生物多样性信息的传送带？ 128 第13章 海洋环境 130 13.1 海洋生态系统中的环境DNA循环和迁移 130 13.2 海洋微生物多样性 131 13.3 海洋大型生物的环境DNA 133 第14章 陆地生态系统 134 14.1 土壤eDNA的可检测性、持久性和迁移性 134 14.2 植物群落特征 136 14.3 蚯蚓群落特征 137 14.4 细菌群落或宏基因组特征 138 14.5 多类群多样性调查 140 第15章 古环境 142 15.1 湖泊沉积物 142 15.1.1 孢粉、大型化石和DNA复合条形码 142 15.1.2 安特纳湖的植物和哺乳动物 143 15.1.3 北美地区“无冰走廊”中的生命力 145 15.2 永久冻土 145 15.2.1 永久冻土作为eDNA来源的概述 145 15.2.2 用于重建过去植物群落的冻土样品大规模分析 146 15.3 考古中的贝冢材料 147 15.3.1 大量来自马达加斯加的考古鱼骨 147 15.3.2 用来自格陵兰的贝冢材料评估过去人类的饮食 147 第16章 与宿主相关的微生物区系 149 16.1 DNA动力学 149 16.2 早期基于分子技术的相关工作 149 16.3 共生体相关延伸工作 151 第17章 食性分析 153 17.1 一些开创性的食性研究 153 17.1.1 概念验证——使用下一代测序分析食草动物的食性 153 17.1.2 比亚沃维耶扎森林保护行动的效率评估 154 17.1.3 食肉动物食性的表征或如何区分捕食者和猎物的eDNA 154 17.1.4 杂食性分析或将多种食性整合到单种食性中 156 17.2 eDNA食性分析的方法学和实验特异性 157 17.2.1 eDNA来源 157 17.2.2 定量分析 159 17.2.3 作为现有生物多样性样品的饮食 162 17.2.4 食性分析存在的问题 162 第18章 混合样品分析 164 18.1 什么是混合样品? 164 18.2 案例分析 164 18.2.1 用于生物多样性监测的昆虫混合样品 164 18.2.2 热带雨林线虫多样性 165 18.2.3 底栖生态系统中的海洋后生动物多样性 166 18.3 混合样品的宏条形码标记物 166 18.4 替代方法 167 第19章 eDNA宏条形码技术展望 169 19.1 基于PCR的方法 170 19.1.1 单标记物方法 170 19.1.2 多重标记物方法 170 19.2 基于鸟枪法的宏条形码技术 170 19.2.1 未通过捕获富集 171 19.2.2 通过捕获富集 171 19.3 趋于更为标准化 172 19.3.1 为了跨研究间的合理比较 172 19.3.2 为了环境监测 173 19.4 下一代参考数据库 174 19.5 尚待研究的问题 174 19.5.1 新的测序技术对eDNA分析有什么影响？ 174 19.5.2 是否会为DNA宏条形码开发一些特定的存储库？ 175 19.5.3 宏条形码是否提供定量结果？ 176 19.5.4 宏条形码是否会完全融入生态学模型和理论？ 176 19.5.5 如何训练学生和管理人员有效地将这个工具整合到学术和业务化的生态研究与监测中？ 177 附录1 用于DNA宏条形码的引物对示例 178 附录2 8个核苷酸的384个标签，其之间至少有3个不同之处 244 附录3 设计基于PCR的DNA宏条形码实验的清单 247 参考文献 249