生化检验技术与应用/临床检验技术与应用

**部分　临床生化分析仪器 　　**章　全自动生化分析仪 　　**节　生化分析仪的发展简史 　　全自动生化分析仪（简称全自动生化仪）是集光、机、电、液于一体的高科技产品，其基本检测原理是朗伯-比尔定律。 　　依据朗伯-比尔定律，诞生了杜伯斯克比色计。检测过程是将两支同样的玻璃柱分别浸入标准溶液与被测液中，光源设在底部，固定标准液中玻璃柱的高度，调整被测液中玻璃柱的高度，使其与标准液的颜色一致，计算出相当于标准液浓度的倍数，从而得出被测液的浓度。20世纪50年代有了光电比色计，其由光源灯、滤光片、光阑、比色杯、光电池和检流计组成。仪器读出的是透光度或百分透光度，透光度与浓度成指数函数关系，需手工做成表格，换算出浓度并填写报告，非常不便。在新中国成立初期，英国EEL型光电比色计被广泛应用于医院的生物化学检验室。 　　1972年意大利驻华大使馆赠送给北京协和医院一台连续流动式生化分析仪；1975年天津医科大学第二医院引进了意大利Carlou Erba公司的二通道连续流动式生化分析仪。1986年我国引进了荷兰Vital公司的MicroLab半自动生化分析仪，其曾在中国被广泛使用，影响较大。Vital公司的半自动生化仪采用点光源、六块干涉滤光板、石英流动比色池，设有终点法、两点法、动力学法。在20世纪80年代，先后还有Monarch离心式生化分析仪、Technicon生化分析仪、日立“7050/7150”等全自动生化仪被批量引进。之后，贝克曼、罗氏等公司的产品开始逐步进入中国。 　　国内厂商在20世纪60年代生产出了“581”型光电比色计，采用悬镜式检流计，对装配、制造技术要求很高；随后又生产出了“721”型可见光分光光度计及各种型号的紫外分光光度计。北京分析仪器厂在研究了连续流动式生化分析仪的基础上，推出了三通道连续流动式生化分析仪，1978年获全国科学大会奖励。上海分析仪器厂也曾研发出分立式自动生化分析仪。这些仪器代表了国内生化分析仪行业早期的发展。 　　经过多年的发展，国内生化分析仪逐渐从半自动过渡到全自动。2003年，迈瑞公司推出中国**台全自动生化分析仪BS-300；之后，国内相继涌现出多家研发和生产全自动生化仪的厂商，包括科华、迪瑞、优立特等。迈瑞公司于2012年研制出中国首台单机测试速度达到2000项/小时的模块化生化分析仪BS-2000M；同时，迈瑞、迪瑞等厂商已研制出高速、模块化流水线产品。这标志着国产生化分析仪已达到进口产品的同等水平。 　　第二节 生化分析的基本原理 　　生化分析检测方法有比色法、离子选择性电极法（ISE）、免疫透射比浊法。基于比色法的分光光度计是所有生化分析仪的基础。免疫透射比浊法是通过反应生成物质对光的透射强度来测定被测物质浓度的方法，主要用于血清特种蛋白的检测。 　　此外，还有一些生化分析仪采用干化学检测技术。干化学分析是将待测液体样本直接加到已固化的特殊结构的试剂载体上，以样本中的水将固化于载体上的试剂溶解，再与样本中的待测成分发生化学反应。 　　在采用液体试剂的生化仪中，通常采用比色法和免疫透射比浊法实现检测，而离子选择性电极法、糖氧化电极法是通过集成在生化仪上的相对独立的检测模块而实现的，本章不作重点介绍，读者可参考第二章内容。 　　一、比色法的检测方法与原理 　　（一）光的特性 　　光是一种电磁波。我们日常所见到的光是400～760nm的电磁波，它是多种有色光的混合光。不同波长的光被人眼所感受到的颜色是不同的。在可见光之外，长波方向是红外线，短波方向是紫外线。 　　光除了波动性外，还具有微粒性。在辐射能量时，光是以单个的、一份一份的能量形式辐射的（E=hv），其中v是光的频率，h为普朗克常量。同样，光被吸收时，也是一份一份地被吸收的。因此，光由具有能量的微粒组成，这种微粒被称为光子。不同波长的光子具有不同的能量。波长越短，频率越高，能量越大；反之亦然。光子的存在可以从光电效应中得到充分证明，这也是自动生化分析仪中进行吸光度检测的基础。 　　（二）光的互补色及光的吸收 　　如果把某两种颜色的光按照一定比例混合，能得到白光，这两种颜色就称为互补色。图1-1中处于直线关系的两种颜色为互补色。 　　图1-1　光的互补色示意图 　　物质的颜色与光的吸收、透过、反射有关。物质的性质和形态不同，因此呈现出不同的颜色。透明物质的颜色就是它透过光波的颜色；不透明物质的颜色是其反射光波的颜色。有色溶液对光的吸收是有选择性的。各种溶液之所以会呈现出不同的颜色，是溶液中的有色质点（分子或离子）选择性地吸收某种颜色的光所致。实践证明，溶液所呈现的颜色是它的主要吸收光的互补色。例如，一束白光通过高锰酸钾溶液时，绿光大部分被吸收，而其他光透过溶液。从互补色示意图可看出，透过光中除紫色外，其他颜色的光两两互补，透过光中只剩下紫色，所以高锰酸钾溶液呈紫色。 　　通常用吸收曲线（也称为吸收光谱）来描述溶液对各种波长光的吸收情况。让不同波长的光通过一定浓度的有色溶液，分别测试它对各种波长光的吸收程度（用吸光度A表示），以波长为横坐标、吸光度为纵坐标，所得到的曲线称为溶液的吸收光谱或吸收曲线。 　　对于任何一种有色溶液都可以测出它的吸收光谱。光吸收*大处所对应的波长称为*大吸收波长。浓度不同的同一种溶液，其吸收光谱的形状、*大吸收波长是一样的。不同物质具有特定的吸收光谱。例如，图1-2所示为对硝基酚（4-NP）溶液不同浓度的吸收光谱。从图中可看出，在可见光范围内，该溶液对波长为400nm左右的光吸收程度*大。从图中还可看出，溶液的浓度越大，对光的吸收程度越大。因此，可利用这部分光线通过溶液后被吸收的程度来确定溶液的浓度。 　　图1-2　同一种溶液（对硝基酚溶液）的三种浓度（C）的吸收光谱（C3>C2>C1） 　　有色物质对光的吸收具有选择性，因此在进行比色测定时，只能用光波中能被有色溶液吸收的那部分光线，即应该用单色光进行比色测定。对于不被有色溶液所吸收的光线，则应在未透过有色溶液之前或之后将其消除。 　　（三）朗伯-比尔定律 　　朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律是利用比色、分光、吸收光谱等分析溶液浓度或物质含量的理论基础，也是生化分析仪的检测基础。 　　朗伯-比尔定律又称为光的吸收定律。如图1-3所示，某一波长的单色光，经过浓度一定、厚度为L的均匀溶液，入射光强度为Io，透过光的强度为It，当入射光强度一定时，溶液的吸光度A与溶液的浓度C、液层厚度L成正比，即A=K×C×L，式中，K称为吸光系数，表示有色溶液在单位浓度和单位厚度时的吸光度。在入射光波长、溶液的温度和种类一定的条件下，K为定值。吸光度（A）与透光度（T）成负对数关系，表达式如下： 　　A=lg（Io/It）=-lg（It/Io）=-lgT 　　图1-3　单色光透过 比色皿示意图 　　二、比浊法的检测方法与原理 　　（一）概述 　　比浊法通常用于蛋白类物质浓度的检测，分为透射比浊法和散射比浊法。透射比浊法通常与生化分析仪的比色法共用光度计，而散射比浊法需要专门的浊度计，通常用于特定的蛋白分析仪。也有些特定的蛋白分析仪同时使用了散射比浊光路和透射比浊光路。 　　（二）光散射原理 　　光的散射是指光通过不均匀介质时，一部分光偏离原方向传播的现象。此时引起光能量损失，光的传输不再具有很好的方向性。偏离原方向的光成为散射光。粒子被光照射后而发光，这一现象主要取决于粒子的大小，即当粒子直径大于入射光波长的一半时就发生散射现象。入射光不一定是单色的，因此当光照射到胶体溶液后，粒子发生的光学现象是很复杂的。 　　根据入射光波长与粒子的相对大小，有以下几种散射理论：Rayleigh（瑞利）散射、Mie（米氏）散射和Debye（德拜）散射。 　　Rayleigh散射公式适用于微粒的直径远小于入射光波长，通常上限为波长的1/10左右，即1～300nm。此时，散射光线的强度与入射光波长的4次方成反比，也就是说，波长越短，散射光越强。如图1-4所示为相对散射光强度与波长的关系。此外，散射光在光线前进方向上和反方向上的强度是相同的，而在与入射光垂直方向上强度*低。Rayleigh散射时，在波长不变的情况下，粒子体积越大，散射光越强。 　　图1-4　Rayleigh散射波长与相对散射光强度 　　当粒子直径与入射光波长比例大于1/10时，各方向上的散射光强度不尽相同，即变为不对称性或各向异性，正向散射光强度趋于增加。这种情况事实上已经偏离了Rayleigh提出的共识，为此Mie和Debye先后对公式进行了修正。这些修正反映了散射光的不对称性与粒子大小及入射光波长之间的相关性变化，即Debye所做的修正适合于粒径略小于入射光波长的情况，Mie的修正更适合于粒径等于或大于入射光波长的情况。图1-5为三种散射的光路示意图。表1-1为三种散射的应用举例。