生物化学与分子生物学实验教程(第2版)

**篇 生物化学与分子生物学实验基本知识与理论 **章 生物化学与分子生物学实验基本知识 一、实验室基本规则 为了保证生物化学与分子生物学实验的顺利进行，培养同学们掌握良好、规范的生物化学与分子生物学基本实验技能，特制定以下实验细则，请同学们严格遵守。 （1）课前认真预习，熟悉本次实验的目的、原理、操作步骤，了解每一操作的意义，了解所用仪器的使用方法，做好实验设计。 （2）严格按照生物化学与分子生物学实验分组，分批进入实验室，不得无故迟到。学生须提前10min到实验室，任课教师提前15min到岗。 （3）进入实验室应穿工作服，不必要的物品不得带入实验室，必须带入的书籍和文具等应放在指定的非操作区，以免受到污染。无菌操作时应按规定戴口罩和手套。 （4）按规定分组进入实验室，应保持安静，实验室内禁止饮食、抽烟，不得大声喧哗和嬉戏，不得随意走动，将手机关闭或置于静音状态。绝对禁止用实验仪器或试剂开玩笑。 （5）应保持实验台的整洁，仪器、试剂摆放整齐，用过的滤纸、手套和EP管等一次性物品放入垃圾桶中，废液倒入废液缸中，禁止直接倒入水槽中或随地乱丢。 （6）要精心使用和爱护仪器，洗涤和使用仪器时，应小心仔细，防止损坏仪器。使用贵重精密仪器前应了解使用方法，使用时要严格遵守操作规程，发现故障立即报告教师，不得擅自移动或动手检修实验仪器。例如，使用分光光度计时，不能将比色杯直接置于分光光度计上，并注意拿、放比色杯时，不要打碎。仪器损坏时，应如实向教师报告，并填写仪器损坏登记表，然后补领。 （7）注意节约试剂，公用试剂用完后，应立即盖严放回原处。勿使试剂、药品洒在实验台或地上。 （8）在实验过程中，听从老师指导，严格按操作规程进行，完成实验后按要求及时书写实验报告，并把实验结果和数据及时、如实记录在实验记录本上，实验报告要真实，文字要简练、准确。若实验失败，应及时分析原因。 （9）实验教学区内严禁吸烟，禁用明火；乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热，并要远离火源操作和放置。 （10）注意节约用水用电，离开实验室前要关好水源、电源，关好门窗，严防事故发生。 （11）实验室内一切物品，未经本室负责教师批准，严禁带出室外，借物必须办理登记手续。 （12）做完实验要清洗仪器、器皿，每次实验课由班长或课代表负责安排值日生。值日生的职责是负责当天实验室的卫生、安全和一切服务性的工作。 （曾益军） 二、实验室基本操作 （一）器皿仪器的清洗 1. 玻璃器皿的清洗在生物化学与分子生物学实验中，所用的玻璃仪器清洁与否，直接影响实验的结果，往往由于仪器的不清洁或被污染而造成较大的实验误差，有时甚至会导致实验的失败。生物化学与分子生物学实验对玻璃仪器清洁程度的要求，比一般化学实验的要求更高。这是因为：①生物化学与分子生物学实验中蛋白质、酶、核酸等往往都是以“毫克”和“微克”计，稍有杂质，影响就很大。②生物化学与分子生物学实验对许多常见的污染杂质十分敏感，如金属离子（钙、镁等）、去污剂等，因此玻璃仪器（包括离心管等塑料器皿）洁净与否，是获得准确结果的重要前提。洁净的玻璃仪器内壁应十分明亮光洁，无水珠附着在玻璃壁上。 （1）*用玻璃仪器的清洗：新购买的玻璃仪器表面常附着有碱性物质，同时常有许多灰尘附在上面，使用前必须彻底清洗。先用洗涤灵稀释液、肥皂水或去污粉等洗刷，用自来水洗净，然后浸泡在1%～2%盐酸溶液中过夜（不少于4h），以中和其碱性物质，再用自来水冲洗，*后用蒸馏水冲洗3次，80℃烘箱烤干备用。 （2）使用过的玻璃仪器的清洗 1）一般玻璃仪器，如试管、烧杯、锥形瓶等，先用自来水洗刷去净污物，再用大小合适的毛刷蘸取洗衣粉、合成洗涤剂或去污粉仔细刷洗器皿内外壁，自来水多次反复冲洗至容器内壁不挂水珠，*后用少量蒸馏水洗2～3次，倒置在器皿架上晾干或置于烘箱烤干备用。 2）容量分析仪器，如吸量管、容量瓶、滴定管等，不能用毛刷刷洗。用后应及时用自来水多次冲洗，细心检查洁净程度，根据挂不挂水珠采取不同处理方法：①如不挂水珠，用蒸馏水冲洗3次，风干备用；②若冲洗后的器皿仍挂水珠，则将其晾干后，用重铬酸钾洗液浸泡4～6h，再用自来水冲洗，*后用蒸馏水洗3次控干。 3）石英和玻璃比色皿的清洗：决不可用强碱清洗，因为强碱会侵蚀抛光的比色皿，需用洗液或1%～2%的去污剂浸泡后用清水冲洗，然后使用绸布包裹的小棒或棉花球棒刷洗，效果会更好。洁净的比色皿应内外壁均不挂水珠。 2. 塑料器皿的清洗聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿已在生物化学与分子生物学实验中广泛使用。初次使用塑料器皿时，可先用8mol/L尿素（用浓盐酸调pH=1）清洗，接着依次用无离子水、1mol/L KOH和无离子水清洗，然后用10?3 mol/L EDTA除去金属离子的污染，*后用无离子水彻底清洗，以后每次使用时，可只用0.5%的去污剂清洗，然后用自来水和无离子水洗净即可。 3. 黏附有血浆的刻度吸量管常用的三种洗涤方法 （1）先用45%尿素溶液浸泡，使血浆蛋白溶解，然后用自来水冲洗。 （2）用1%氨水浸泡，使血浆溶解，然后再依次用1%稀盐酸溶液、自来水冲洗。 （3）以上两种方法如达不到清洁要求，可浸泡于重铬酸钾洗液4～6h，再用大量自来水冲洗，*后用蒸馏水冲洗2～3次。 4. 其他盛过传染性样品的容器，应进行高压或其他方法消毒。盛过有毒药品、放射性同位素试剂的容器，必须经过专门处理，确知没有残余物存在方可进行清洗。凡用过的玻璃仪器，均应立即洗涤，久置干涸后洗涤十分困难。如不能及时洗涤，先用流水初步冲洗后浸泡在清水中，待实验后按常规处理。 5. 洗涤液的种类和配制方法 （1）重铬酸钾洗液（以下简称洗液）的配制及注意事项 1）洗液的配制：洗液可配制成三种不同的强度，其成分用量见表1-1-1。 配制洗液时先将重铬酸钾溶于蒸馏水中，必要时可加热帮助溶解，待冷却后再将浓硫酸缓慢加入，边加边搅拌。注意此时可产生高热。为防止容器破裂，应选用耐酸搪瓷缸或耐高温的玻璃器皿，切忌用量筒及试剂瓶等配制。为防止洗液吸收空气中的水分而被稀释变质，洗液应储存于带盖的容器中。一般*常用的为次强液。 表1-1-1 铬酸洗液的配制 2）使用时应注意以下几点：①需用洗液浸泡的容器，在浸泡前应尽量沥干，否则会因洗液被稀释而降低洗液氧化力。②Hg2+、Ba2+、Pb2+ 等可与洗液发生化学反应，生成不溶性化合物沉积在容器壁上。因此，凡接触过上述离子的容器，应先除去上述离子（可用稀硝酸或5%～10% EDTA清除）。③油类、有机溶剂等有机化合物可使洗液还原失效。因此，容器壁上附有大量油类、有机溶剂时应先去除。④洗液的酸性和氧化性很强，使用时应格外注意，千万不要滴落在皮肤或衣物上，以免灼伤或烧坏。⑤洗液颜色由深棕色变为绿色时，说明洗液已经失效，应停止使用，更换新液，因重铬酸变成硫酸铬后不再具有氧化能力。 （2）其他洗涤液 1）工业浓盐酸：可洗去水垢或某些无机盐沉淀。 2）5%草酸溶液：用数滴硫酸酸化，可洗去高锰酸钾的痕迹。 3）5%～10%磷酸三钠（Na3PO4 12H2O）溶液：可洗涤油污物。 4）30%硝酸溶液：洗涤二氧化碳测定仪及微量滴管。 5）5%～10%乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液：加热煮沸可洗脱玻璃仪器内壁的白色沉淀物。 6）尿素洗涤液：为蛋白质的良好溶剂，适用于洗涤盛过蛋白质制剂及血样的容器。 7）有机溶剂：如丙酮、乙醚、乙醇等可用于洗脱油脂、脂溶性染料污痕等，二甲苯可洗脱油漆的污垢。 8）氢氧化钾的乙醇溶液和含有高锰酸钾的氢氧化钠溶液：这是两种强碱性的洗涤液，对玻璃仪器的侵蚀性很强，可清除容器内壁污垢，洗涤时间不宜过长，使用时应小心慎重。 6. 玻璃和塑料器皿的干燥通常使用烘箱或烘干机进行干燥，而不要用丙酮荡洗再吹干的方法来干燥，因为那样会有残留的有机物覆盖在器皿的内表面，从而干扰实验结果。 （二）吸量管和微量移液器的使用 1. 吸量管的种类及使用方法 （1）刻度吸量管 1）刻度吸量管的种类：①按容量规格来分，有0.1ml、0.2ml、0.25ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml、10ml等数种。其精密度按不同的容积可达移取量的0.1%～1%。通常将管身标明的总容量分刻为100等分。因此，10ml的吸量管一格代表0.1ml；1ml的吸量管一格代表0.01ml，其余类推。②按“0”点位置来分，有“0”点在吸量管上端的（即读数从上而下逐渐增大），也有“0”点在吸量管下端的（读数从下而上逐渐增大）。两种标示方法，在使用时各有方便之处。③按刻度方法来分，刻度吸量管也有两种，一种是刻度刻到尖端的，将液体放出时，应吹出残留在吸量管尖端的少量液体，另一种是刻度不刻到尖端的。 2）刻度吸量管的正确使用方法：在吸取液体时，*先认清试剂标签，选择容量大小合适的吸量管，用右手拇指和中指拿住吸量管上端，将吸量管的尖端伸入待取液体的液面下约1cm处，左手持洗耳球对准吸量管上口，轻轻吸取，使液体从吸管下端徐徐上升，当液面升到刻度以上时，移去洗耳球，迅速用右手食指按紧吸量管的上口，以控制试剂的泄放。将吸管下端提离液面并接触瓶颈内壁，吸液后应尽量使吸量管保持垂直，此时视线平视吸管刻度标线，稍松抬右手食指或轻轻转动吸量管，液面即缓缓下降。待液体弯月面的*低点与吸量管的刻度相切时，立即按紧食指，使液体不再流出，将吸量管移入准备接收试剂的容器中，其尖端接触容器内壁，松开右手食指使液体自然流出，待液体流完后再等15s，捻动一下吸量管后移去（如需吹的吸量管，则吹出尖端的液体后再捻转一下吸量管移去）。 3）使用刻度吸量管的注意事项：①选择适当规格的吸量管，吸量管的*大容积应等于或略大于所需容积（ml）；②仔细看清吸量管的刻度情况，弄清刻度是否包括吸量管尖端的液体，读数方向是自上而下，还是自下而上；③拿吸量管时，刻度一定要面向自己，以便读数；④吸取试剂时应注意三点：一是先吹去吸量管内可能存在的残留液体，二是将吸量管插入试剂液面深部（以免吸液过程中因液面降低而吸入空气产生气泡或管内试剂进入洗耳球），三是使用洗耳球（不可直接用口吸）；⑤按吸量管上口时通常用食指；⑥吸取黏滞性大的液体（如血液、血浆、血清等）时，除选用合适的吸管外，应注意拭净管尖附着的液体，尽量减慢放液速度，待液体流尽后吹出管尖残留的*后一滴液体；⑦使用的吸量管应干净、干燥无水。如急用而又有水时，可用少量欲取试剂冲洗3次，以免试剂被稀释。 （2）移液吸量管：常用量取50ml、25ml、10ml、5ml、2ml、1ml的液体，常见的一种是吸量管的上端只有一个刻度，另一种是除了在吸量管上端有刻度外，在吸量管下端狭窄处也有一刻度线。无论哪一种，在使用时将量取的液体自然流出后，只需将吸量管的尖端触及受器壁约半分钟即可，不得吹出尖端残留的液体。 （3）奥氏吸量管：供准确量取0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml液体所用。这种吸量管只有一个刻度，当放出所量取的液体时，管尖余留的液体必须吹入容器内。 （4）使用原则：量取整数量液体，并且取量要求准确时，应该选用奥氏吸量管。量取大体积时要用移液吸量管。同一定量实验中，如欲加同种试剂于不同的管中，并且取量不多时，应选择一支与*大取液量接近的刻度吸量管。 2. 定量吸（移）液器（微量加样器） （1）定量吸液器的优点：使用方便，取、加样迅速，计量准确，不易破损，能吸取多种样品（只换吸头即可）。<