微生物生物学实验教程

**章 显微技术 实验一 亮视野显微镜的使用 一、实验目的 1.熟悉普通亮视野显微镜的构造及各部分的功能。 2.学习并掌握油镜的工作原理及正确的使用方法。 二、实验原理 (一)显微镜的基本构造 普通亮视野显微镜是一种精密的光学仪器，通常能将物体放大1500～2000倍。它的构造可分为两大部分：一为机械装置，二为光学系统（图1-1)，只有这两部分很好地配合使用，才能发挥显微镜的作用。 图1-1 普通亮视野显微镜的成像原理示意图 1.机械装置 普通亮视野显微镜的机械装置部分包括：镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗调螺旋、细调螺旋。 2.光学系统 普通亮视野显微镜的光学系统包括：光源、物镜、聚光器、目镜。 显微镜的物镜使被检物体**次成像，物镜成像的质量对显微镜的分辨率有着决定性的作用。物镜的性能取决于物镜的数值孔径（numerical aperture，NA)，每个物镜的数值孔径都标在物镜的外壳上，数值孔径越大，物镜的性能越好。根据物镜放大率的高低，可分为①低倍物镜：指l×～6×，NA值为0.04～0.15。②中倍物镜：指6×～25×，NA值为0.15～0.40。③高倍物镜：指25×～63×，NA值为0.35～0.95。④油镜：指90×～lOO×，NA值为1.25～1.40。 聚光器安装在载物台下，其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，以得到*强的照明，使物像获得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以调节，使焦点落在被检物体上，以得到*大亮度。 目镜的作用是把物镜放大了的物像再放大一次，并把物像映入观察者的眼中。目镜的结构较物镜简单，普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成，上端的透镜称“接目镜”，下端的透镜称“场镜”。 (二）光学显微镜的成像原理 显微镜的放大功能是通过透镜来完成的，单透镜成像具有像差，影响像质。由单透镜组合而成的透镜组相当于一个凸透镜，放大作用更好。图1-1是显微镜的成像原理模式。 (三）显微镜的性能 显微镜分辨能力的高低决定于光学系统的各种条件。被观察的物体必须放大率高，而且清晰。物体放大后，能否呈现清晰的细微结构，首先取决于物镜的性能，其次为目镜和聚光器的性能。 1.数值孔径 数值孔径也称镜口率（或开口率)，简写为NA，在物镜和聚光器上都标有数值孔径。数值孔径是物镜和聚光器的主要参数，也是判断它们性能的*重要指标。数值孔径和显微镜的各种性能有密切关系，它与显微镜的分辨率成正比；与焦深成反比；与镜像亮度的平方根成正比。 数值孔径（NA)可用下式表示： NA=n sina 式中，n——物镜与标本之间的介质折射率； a——*大入射角的半数，即物镜的镜口角的半数。所谓镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度，见图1-2。 图1-2 物镜的光线入射角 镜口角总是小于180。。因为空气的折射率为1，所以干燥物镜的数值孔径总是小于1，一般为0.05～0.95；油镜如用香柏油（折射率为1.515)浸没，则数值孔径*大可接近1.5。虽然理论上数值孔径的极限等于所用浸没介质的折射率，但实际上从透镜的制造技术看，是不可能达到这一极限的。通常在实用范围内，高级油镜的*大数值孔径是1.4。 几种物质的介质的折射率如下：空气为1.0，水为1.33，玻璃为1.5，甘油为1.47，香柏油为1.52。 介质折射率对物镜光线通路的影响见图1-3。 图1-3 物镜干燥系（A)与油浸系（B)的光线通路 2.分辨率（D) 分辨率D可用下式表示。 可见光的波长a为0.4～0.7pm，平均波长为0.55pm。这也是肉眼所能感受的光波的平均长度。若用数值孔径为0.65的物镜，则0=0.55/(2×0.65)=0.42um。这表示被检物体长度在0.42um以上时可见，若小于0.42um就不可见。如果使用数值孔径为1.25的油镜时，则D=0.55/(2×1.25)=0.22pm，凡被检物体长度大于这个数值，均可见。由此可见，D值越小，分辨率越高，物像越清晰。根据上式，可通过：①减低波长；②增大折射率；③加大镜口角来提高分辨率。紫外线作光源的显微镜和电子显微镜就是利用短光波来提高分辨率以检视较小物体的。物镜分辨率的高低与造像是否清楚有密切关系；目镜没有物镜所具有的这种性能，目镜只放大物镜所造的像。 3.放大率 显微镜放大物体，首先经过物镜**次放大造像，目镜在明视距离造成第二次放大像。放大率就是*后的像和原物体两者体积大小之比。因此，显微镜的放大率(V)等于物镜放大率（K)和目镜放大率（F2)的乘积，即。 4.焦深 在显微镜下观察一个标本时，焦点对在某一像面时，物像*清晰，这像面为目的面。在视野内除目的面外，还能在目的面的上面和下面看见模糊的物像，这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深和数值孔径及放大率成反比，即数值孔径和放大率越大，焦深越小。因此调节油镜比调节低倍镜要更加仔细，否则容易使物像滑过而找不到。 三、实验材料 光学显微镜、擦镜纸、吸水纸、无水乙醚：无水乙醇（3：1)混合液或二甲苯置于双层瓶中。 四、实验步骤 显微镜结构精密，使用时必须细心，要按下述操作步骤进行。 1.观察前的准备 (1)显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。 (2)将显微镜放在自己身体的左前方，距离桌子边缘约10cm，右侧可放记录本或绘图纸。 (3)将10×物镜转入光路，将聚光器上的虹彩光圈打开到*大位置。打开电源，用双眼观察目镜中视野的亮度，通过调节电流旋钮来调节光照强弱，使视野的光照达到*明亮*均匀为止。 (4)调节光轴中心，在使用显微镜进行观察时，其光学系统中的光源、聚光器、物镜和目镜的光轴及光阑的中心必须跟显微镜的光轴同在一条直线上。 2.低倍镜观察 镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。 将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调螺旋，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调螺旋慢慢升起镜筒（或下降载物台），直至物像出现，再用细调螺旋使物像清晰。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。 3.高倍镜观察 在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的，在正常情况下，高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。若使用不同型号的物镜，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调螺旋，使载物台上升（或镜筒下降)，直至物像出现，再用细调螺旋调至物像清晰，找到需观察的部位，并移至视野中央进行观察。 4.油镜观察 油镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油镜没有“弹簧装置”，因此使用油镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。 5.油镜的使用 (1)先用粗调螺旋将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出。 (2)在玻片标本的镜检部位滴上1滴香柏油。 (3)从侧面注视，用粗调螺旋将载物台缓缓地上升（或镜筒下降)，使油镜浸入香柏油中，直至镜头几乎与标本接触。 (4)从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器，使光线充分照明。用粗调螺旋将载物台徐徐下降（或镜筒上升)，当出现物像一闪后改用细调螺旋调至*清晰。如油镜已离开油面而仍未见到物像，必须再从侧面观察，重复上述操作。 (5)观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许无水乙醚：无水乙醇（3：1)混合液或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，*后再用擦镜纸擦拭2～3下即可（注意：要向一个方向擦拭，同时不要过量使用二曱苯，以免其残留在镜头上影响观察)。 (6)将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成“八”字形位置，再将镜筒下降至*低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用一个干净手帕将接目镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。*后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。 五、实验结果 学会光学显微镜的使用，并学会对不同微生物示范片（如细菌、真菌）进行观察。 六、思考题 1.请说出双层瓶中液体的成分和用途，用光学显微镜观察细菌制片时吸水纸和擦镜纸各有什么用途？ 2.为什么在观察细菌制片时多使用油镜？使用油镜时应注意些什么？如何清理？ 3.如何确定光学显微镜中图像的放大倍数？什么是显微镜的分辨率？光学显微镜*大的分辨率一般是多少？ 4.你在实验过程中使用过何种显微镜？通常有几种型号的物镜？如何区分？它们的放大倍数一般是多少？请说出在观察下列微生物形态时，应使用多大放大倍数的物镜头？ A.大肠杆菌 B.酵母菌 C.蓝细菌 D.曲霉 E.黑化链霉菌 七、参考文献 刘国生.2007.微生物学实验技术.北京：科学出版社 Madigan M T，Martinko J M，Stahl D A，et al.2012.Brock Biology of Microorganism.13th ed.Boston Benjamin Cummings 实验二 暗视野显微镜的使用 一、实验目的 1.学习暗视野显微镜的工作原理及使用方法，了解其应用范围。 2.掌握使用暗视野显微镜观察微生物样品形态及细菌运动性的基本技术。 二、实验原理 暗视野显微镜工作的基本原理是丁达尔效应：当一束光线透过黑暗的房间，从垂直于入射光的方向可以观察到空气里出现一条光亮的灰尘“通路”。暗视野显微镜是在普通亮视野显微镜的结构基础上改造而成的，它使用专用的聚光镜，其中央有挡光片，使照明光线不能由下而上地通过直射进入物镜，从而使光改变路径，只有被标本反射和衍射的光线从周边进入物镜（图2-1)，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的（图2-2)。 图2-1 暗视野显微镜与亮视野显微镜工作原理对比及挡片的形态示意图（引自：Omoto et al.，1999)