生物技术综合实验

第1篇 基因工程 20 世纪70 年代以来，现代生物技术飞速发展。随着一系列新技术、新方法的不断出现，广大生物学家通过不懈的努力，开拓了许多新的研究领域，对生物科学的研究现状有了质的提升。其中，*引人注目并被公认的是以DNA 重组为中心的基因工程技术。 基因工程C gene engineering) ，又称基因操作C gene manipulation) 或重组DNA Crecombinant DNA) ，是一门以分子遗传学和分子生物学理论为基础，以生物化学和微生物学的现代方法为手段，将来源不同的遗传物质(基因)即DNA 分子，按照预先设计的蓝图， 在体外构建所需的DNA 片段，然后通过载体导入受体细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新物种(品种) ，或研究基因结构与功能的现代生物技术。 从定义可以看出，基因工程的一个重要特征，就是强调了外源DNA 分子的新组合被引入一种新的寄主生物中进行繁殖。这种DNA 分子的新组合是按照工程学的方法进行设计和操作的。这就赋予了基因工程跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的生物物种间的限制，带来和扩大了定向创造新生物的可能性。这是基因工程的*大特点。 而基因工程*大的优点是打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间，甚至人与其他生物之间的遗传信息进行重组和转移。 自DNA 重组技术于1972 年诞生以来，作为现代生物技术核心的基因工程技术得到了飞速的发展，并广泛应用于医学、农业、工业、水产、环保等行业。本篇实验在方法上，力求具有可行性、实用性，内容涵盖基因工程操作的基本过程，整个实验基本上是一个连续的过程，通过学习，要求学生能在原有的相关理论知识基础上， 较全面和深入理解基因工程原理，掌握基本的基因工程常用实验方法。 第1章 基因工程常用技术 基因工程技术的可行性基于以下方面的原理。 1.不同基因具有相同的遗传物质基础 地球上的一切生物，从细菌到高等动物和植物，直至人类，其基因都是一个具有遗传功能的含特定核背酸序列的DNA 片段。而所有生物的DNA 的组成和基本结构都是一样的。因此，不同生物的基因(DNA 片段〉原则上是可以重组互换的。虽然某些病毒的基因定位在RNA 上，但是这些病毒的RNA 仍可以通过反转录产生DNA ，并不影响不同基因的重组或互换。 2. 基因是可以切割的 基因是以直线排列在DNA 分子上。除少数基因重叠排列外，大多数基因彼此之间存在着间隔序列。因此，作为DNA 分子上一个特定核昔酸序列的基因，可以从DNA 分子上一个一个完整地切割下来。即使是重叠序列的基因，也可以把其中需要的基因切割下来，但是破坏了其他的基因. 3. 基因是可以转移的 基因不仅是可以切割下来的，而且发现携带基因的DNA 分子可以在不同生物体之间转移，或者在生物体内的染色体DNA 上移动，甚至可以在不同染色体之间进行跳跃，插入靶DNA 分子之中。由此表明基因是可以转移的。 4. 多肽与基因之间存在着对应关系 普遍认为，一种多肤就有一种相对应的基因。因此，基因的转移或重组*终可以根据其表达产物多肤的性质来考察。 5. 遗传密码是通用的 一系列三联密码子(除极少数几个外〉同氨基酸之间的对应关系，在所有生物中都是相同的。也就是说遗传密码是通用的，重组的DNA 分子不管导人什么样的生物细胞中，只要具备转录翻译的条件，均能转录翻译出同样的氨基酸。即使人工合成的DNA 分子(基因)同样可以转录翻译出相应的氨基酸。 6. 基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代 经重组的基因一般来说是能传代的，可以获得相对稳定的转基因生物。 基因工程部分的实验内容总体分为基因工程常用技术、目的基因的原核表达体系及目的基因的真核表达体系三个方面，基本流程如图1 所示。 主要包括以下实验内容。 (1)从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的DNA 片段或RNA 片段，同时对提取的目的基因进行琼脂糖凝胶电泳分离检测. (2) 载体的获得z 提取质粒等载体;通过PCR 技术获得大量的目的基因;在体外将带有目的基因的DNA 片段连接到具有选择标记的质粒载体上，形成重组DNA 分子。将目的基因与载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA 重新组合的过程。 (3) 将目的基因导人受体细胞:用人工的方法使体外重组的DNA 分子转移到受体细胞，主要是借鉴细菌(转化)或病毒(转导)侵染细胞的途径。 (4) 扩增带有重组体的细胞，获得大量的细胞繁殖群体(菌落) 。 (5) 从大量的细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组DNA 分子的阳性克隆。 (6) 进一步研究分析筛选出的细胞克隆的目的基因。 (7) 将目的基因克隆到表达载体上，导人寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的各种物质。 实验1 染色体DNA 的制备一一植物总DNA 的提取 【实验目的】 (1)学习和掌握CTAB 法提取植物总DNA 的基本原理和实验技术。 (2) 学习和掌握紫外吸收法测定DNA 的纯度和浓度。 【实验原理】 在液氮冷冻下研磨植物叶片，可使细胞壁破裂，加人十六烧基三甲基澳化镀(CTAB) 和青疏基乙醇，可使核蛋白体解聚，然后使蛋白质和多糖杂质沉淀， DNA 进入水相，再用盼、氯仿抽提纯化。 本实验采用CTAB 法，其主要作用是破膜。CTAB 能溶解膜蛋白与脂肪，解聚核蛋白。植物材料在CTAB 的处理下，结合65 'c水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB 与核酸形成复合物，此复合物在高盐(>0. 7 mol/L)浓度条件下可溶于溶液中，并稳定存在，但在低盐浓度(0. 1~0. 5 mmol/L NaCl)条件下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/异戊醇(24 : 1)抽提，去除蛋白质、多糖、色素等杂质，获得纯化的DNA ，*后经乙薛沉淀将DNA 分子沉淀分离出来。 核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长下都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260 nmo 纯的DNA 样品吸光度A260 /A，80 句1. 8 ，纯的RNA 样品吸光度A260/A阳电2.0 ，1μg/mLDNA溶液的A260 =0.020 。 【器材】 1.试剂 (1) 3XCTAB 缓冲液(pH8. 0): Tris ？ HC1(pH8. 0) EDTA(pH8.0) NaCl CTAB 使用前加入2%(V/V)萨疏基乙醇. (2) TE 缓冲液(pH8. 0): 100 mmol/L 25 mmol/L 1. 5 mol/L 3% Tris ？ HCl 10 mmol/L EDTA 1 mmol/L (3) 其他试弗U: 氯仿/异戊醇混合液(24: l ， V厅〕、95% 乙醇、液氮、新鲜的植物叶片(根据实验目的自行选择，如小白菜叶) 2. 仪器 高压灭菌锅，恒温水浴锅，高速冷冻离心机，紫外分光光度计等。 【操作步骤】 (1)称取2g 新鲜的植物叶片，用蒸馆水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 (2) 将叶片剪成约1 cm 长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉未。 (3) 待液氮蒸发完后，加入15 mL预热(60 'C)的CTAB 提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于65 'c水浴保温1 h ，不时地轻轻摇动混匀。 注:CfAB 缓冲渡放在65 'c水浴中预热90 min ，加入2% (V!V) 仕琉基Z醇。如果量少，可以在1.5 此的离心管中进行。注意液氮研磨时，小.t，操作，*好戴上棉布手套，以免冻伤。 (4) 加等体积的氯仿/异戊醇，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液， (5) 将锥形瓶中的液体倒入50 mL离心管中， 4 'C， 8000 r/min 离心10 mino (6) 离心管中会出现3 层，用滴管小心地将上层清液吸人另一干净的离心管中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白及下层的氯仿(根据需要，上清可用氯仿/异戊醇反复提取多次) 。 (7) 收集上层清液，并将其倒人小烧杯.沿烧杯壁慢慢加人2 倍体积预冷的95 % 乙醇。边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀(主要为DNA)迅速缠绕在玻棒上。 注:玻璃棒要缰慢沿着同-方向搅动，避免将DNA 链打断。 (8) 小心取下这些纤维状沉淀，加1~2 mL 70% 乙醇冲洗沉淀，冲洗2 次，轻摇几分钟，除去乙醇，即为DNA 粗制品。 (9) 将粗制品溶于70%乙醇，缓和颠倒数次，4 "c ，8000 r/min 离心10 min。弃上清。 (10) 将DNA 沉淀风干，并用双蒸水溶解。 (11) 在紫外分光光度计上分别测定该榕液在260 nm 和280 nm 波长下的吸光度。 (12) PCR 操作时，吸取样品溶液1μL. 剩余样品放人-20 "c保存。 【结果】 根据测得的260 nm 和280 nm 波长下的吸光度判断提取DNA 的纯度，并估算DNA 的浓度及含量。 【思考题】 (1)自疏基乙醇和CTAB 的作用分别是什么? (2) 液氮研磨的原理是什么? (3) 分析实验结果，并讨论实验材料中的哪些物质对结果有影响。