生物化学与分子生物学实验(第2版)

概述 一、生物化学与分子生物学实验课的性质、任务与目的 生物化学与分子生物学是一门重要的实验性基础医学学科。生物化学与分子生物学的实验技术和方法不仅为生物化学与分子生物学的迅速发展创立了条件，也为其他基础医学和临床医学的研究奠定了基础。生物化学与分子生物学实验课是帮助同学掌握基本实验技能、基本实验操作技术，提高独立思考、独立分析和独立解决问题的能力，学会正确的科研思维方法，养成严谨的科学作风，把同学们所学得的理论知识和实验内容相结合的重要手段。 近代医学的发展经常运用生物化学与分子生物学理论与技术诊断、治疗和预防疾病，许多疾病的发病机制也需要从分子水平加以探讨。特别是近年来，随着生物化学与分子生物学的迅速发展促进了人们对许多疾病如恶性肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病、免疫系统疾病等重大疾病的认识，随之出现了基因诊断和基因治疗的方法。由于生物化学与分子生物学理论是在科学实验研究基础上高度总结的结论性观点，所以生物化学与分子生物学实验课一方面使学生在实验中验证理论的来源与正确性、加深对理论的理解；另一方面，生物化学与分子生物学实验手段又是生命科学发展的必用手段，而实验课是培养学生科研能力和素质的必要和重要过程。 通过生物化学与分子生物学实验课，可以使同学们掌握生物化学与分子生物的基本操作技术，培养学生独立思考和实事求是的科学态度，为今后从事从事科研工作和临床实践应用奠定基础。 二、生物化学与分子生物学实验室安全与规则 （一）实验室安全 1.实验室建立安全责任人制度，由实验室主任全面负责实验室的安全工作。 2.定期进行实验室安全知识教育，增强安全意识，严格管理，预防和避免各类事故的发生。 3.定期检查实验室水、电、煤气线路，发现隐患及时解决。消防器材专人管理，位置固定，工作人员熟练使用，能应对紧急情况发生。 4.保持实验室内空气流通。凡对身体有害气体的实验及试剂的配制要求在通风橱内操作，并佩戴好相应的防护工具。 5.实验室中易燃易爆和剧毒物品必须妥善保管，统一存放，设立危险品标志，使用时注意规范操作。 6.凡涉及使用毒麻药品和危险试剂时，遵照《危险性试剂及毒麻药品使用管理规定》执行。 7.对参加使用操作的人员要进行安全知识及相关仪器设备使用的指导，对于大型仪器设备要有专人负责操作。 （二）实验室规则 生物化学与分子生物学实验的很多试剂都具有强烈的腐蚀性和剧毒性，因此，在实验操作过程中要严格遵守操作规程，小心操作。 1.生物化学与分子生物学实验具有独*的实验技能，在教师的指导下，学生应认真完成每次实验内容。 2.实验前认真预习实验内容，明确实验目的，理解实验基本原理及大体操作步骤。 3.实验中正规操作，掌握关键环节，认真观察，做好实验记录，数据和结果真实。 4.实验后及时总结，并对实验结果进行综合分析，展开讨论，按时完成实验报告。 5.遵守实验室各项规章制度，爱护仪器。节约使用试剂、煤气、水、电等，保持室内卫生。 6.遵守课堂纪律，不迟到不早退，实验室内严禁吸烟、饮食、大声喧哗，同学之间应互助友爱。 7.实验完毕后，要按照各种器材（如试管、比色杯等）的清洗方法进行清洗；要关闭仪器设备的开关和电源，并将仪器整理好；打扫卫生并关好实验室门窗，经实验室工作人员检查合格后方可离开。 三、实验报告书写 生物化学与分子生物学实验课要求同学们在实验中严肃认真地进行操作，如实记录所观察到的各种现象和得到的实验数据，并要求实验后认真总结和分析，完成实验报告。 （一）实验记录 实验记录是指在实验中将观察到的现象和测量的数据及时、准确、翔实记录在记录本上。此记录必须客观，不可掺杂任何主观因素，不受已有资料及他人实验结果的影响。每个结果尽可能观测2次以上。 完整的实验记录应包括日期、实验内容、现象及结果，使用仪器的型号及生产厂家；生物材料的来源、选用的组织及其重量；试剂的规格和浓度等。 （二）实验报告 实验报告是实验的总结和综合分析，通过实验报告的写作可以学会实验数据的处理方法，加深对实验理论和实验技术的理解和掌握，同时也是学习撰写科学研究论文的过程。 完整实验报告的内容包括实验名称、实验目的、实验原理、实验操作、实验结果、讨论、结论、实验者和实验日期等。 （王顺） **章基本实验操作与常用技术及仪器的使用 **节基本实验操作 一、玻璃器皿的洗涂与干燥 生物化学与分子生物学实验所用器材必须清洁，以免杂质污染，影响实验结果。在定量分析实验中要求更加严格。 （一）可用毛刷刷洗的玻璃器皿清洗方法 一般容器如烧杯、试管、三角瓶等先用自来水冲洗，用毛刷蘸肥皂粉或去污粉刷洗，然后用自来水冲洗，至器壁光洁不挂水珠，*后以少量蒸馏水冲洗3次，倒置晾干即可。 （二）不能用毛刷刷洗的玻璃器皿清洗方法 吸管、容量瓶等不能用毛刷刷洗，先用自来水冲洗，然后用洗液浸泡数小时，捞出并倒净洗液，用自来水充分冲洗至水不显黄色后再冲几次，*后用少量蒸馏水冲洗2～3次晾干备用。 在做酶学实验时，对器材的清洁要求更高，因如有极微量的污物（如重金属离子）即可导致整个实验失败。因此，必要时，器皿经上述方法洗涤后，还需用稀盐酸或稀硝酸洗涤，以除去铬及其他金属离子，然后再用自来水、蒸馏水冲洗。 （三）生化实验室常用的洗液 1.铬硫酸液浓度一般为5%或10%。 （1）5%铬硫酸液的配制方法：取重铬酸钾粉末5g，放烧杯中，加水5ml，搅拌使其尽量溶解（可小火加热），然后缓缓加人粗浓硫酸100ml，边加边摇勻。溶液由红色变成棕红色，冷却后倒人有盖的容器内保存。 铬硫酸液清洁效力主要利用其强氧化性。当遇有被氧化物质存在时，发生氧化还原反应，氧化作用很强，可以使有机物炭化，进一步氧化分解。硫酸越浓，铬酐越多，则清洁效力越强。当洗液变成绿色时，即失去氧化能力。 （2）铬硫酸液配制注意事项：①重铬酸钾有毒，配制和使用时一定要注意，小心操作；②配制铬硫酸液时注意安全，要把硫酸缓慢地加到水里；③使用铬硫酸液时要小心，不要減到眼、皮肤和衣服上；④用铬硫酸液浸泡仪 器时，尽量把仪器先用水冲洗干净，并使其干燥，再浸人洗液内，以防吸水，可以较长时间使用。 2.10%尿素液为蛋白质良好溶剂，适用于洗涤盛血的容器。 3.草酸盐液用于清洗过锰酸钾的痕迹。 4.硝酸液用1:1的硝酸水溶液，用于清洗CO2测定器及微量滴定管。 5.乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）液5%～10%的EDTA-Na2液可用于洗涤器皿内无机盐类。 （四）玻璃器皿的干燥 玻璃器皿的干燥方法可根据不同仪器种类而定。一般地说洗净后的玻璃仪器，如不急用应倒置放在晾架上令其自然干燥，若有急用可放在烘烤箱中烤干（105～110T，1h）。但容量玻璃仪器，如容量瓶、吸量管、滴定管以及烧结、结构复杂的玻璃仪器等，严禁烘烤。此类玻璃仪器，如急用可采用水栗抽气法干燥。 二、移液器的使用 （一）刻度吸量管 吸量管是生物化学与分子生物学实验中*常用的量器，实验结果的准确程度与能否正确使用吸量管有密切关系。因此必须熟悉各种吸量管的规格，掌握正确使用方法。 1.吸量管规格常用的吸量管包括：①刻度吸管，如1ml、2ml、5ml、10ml等规格；②微量吸量管，如0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.5ml等规格，使用时要根据实际需求选用合适规格的吸量管。 2.吸量管的使用方法取液时，用右手拇指和中指夹住管身上端，使食指能自由按住上口，用左手拿洗耳球。吸取液体时，待液面上升到所需刻度线的上方，迅速用右手食指按住上口，用滤纸擦去管身下端外壁吸附的多余液体，然后稍松食指，调整液面下降到所需刻度。调整刻度时，吸管垂直，液面与眼同高，视线、液面凹面底部与所需刻度在同一水平。放液时，把吸管插进受器，使吸管尖端接触管壁，与受器成一定角度，使液体自然流出，或根据食指与上口接触松紧程度来控制流出速度。在使用吸量管量取总量或用下段时，必须在液体流出后，停留10～15秒，转动吸管，使尖端内部液体流出。使用微量吸管时，放出液体后，吸管尖端靠壁停留10～15秒，然后用洗 耳球把吸管尖端液体吹出。 （二）可调式移液器 1.移液器规格与种类移液器是分子生物学实验中常用的微量移液装置，常用的有0.1～2.5pl、0.5～10pl、2～20pl、5～50pl、10～100pl、20～2000、50～2000、100～10000等不同规格，使用时注意根据实际需求选用合适的移液器。 可调式移液器有单道和多道（如8道、12道等）等不同种类，可根据具体的实验来进行适当的选择。 2.移液器使用方法 （1）做好移液前准备，戴好手套，根据实验所需，选择相应规格的移液器及枪头（图1-1a）。 （2）旋转移液器量程按钮，设定移液量（图1-1b）。 （3）安装枪头（图1-1c），并用拇指把按钮压至**挡（图1-1d）。 （4）吸液：垂直握持加样器，使枪头浸人液面下2～3mm处，然后缓慢平稳地松开按钮，使其复原，吸人液体，停留片刻，然后将枪头提离液面，贴壁停留2～3秒，使管尖外侧的液滴滑落（图1-1e） （5）放液：枪头贴到受器内壁底部，平稳地把按钮压到**挡后，再把按钮压到第二挡，排尽液体（图1-1f） （6）松开按钮，恢复至原来的位置（图1-1g）。 （7）按枪头弹射器弃去枪头（图1-1h）旋转移液器量程按钮，恢复至*大量程，将移液器放回移液器支架。 d.按钮按压至**挡位置e.吸液，枪头尖端插入液面下，轻抬拇指吸取液体 f.放液，按压至**挡后，再按压第二挡，排尽液体g松开按钮，恢复至原来的位置 h.按枪头弹射器弃去枪头图1-1可调式移液器的使用方法 3.移液器使用注意事项 （1）每天开始工作之前应检查移液器的外表面是否有灰尘或污物；若有，则小心抹去。 （2）吸取液体时应缓慢均勻吸取，避免液体減到移液器头上；排出液体后拇指不应松开按钮，枪头离开液面后再将拇指松开，避免液体回吸。 （3）在调整取液量的旋钮时，不要用力过猛，并应注意计数器显示的数字不要超过其可调范围。 （4）连续可调式移液器在取样加样过程中应注意枪头不能触及其他物品，以免被污染；枪头盒、废液瓶、所取试剂及加样的样品管应按规定摆放，以方便操作和避免污染。 （5）可调式移液器在使用完毕后应放置于移液器支架上，远离潮湿及腐蚀性物质。 （6）在移液操作过程中，为防止液体进人加样器套筒内，必须注意：①压放按钮时保持平稳；②加样器不得倒转；③枪头中有液体时不可将加样器平放。 （7）移液器应根据使用频率进行维护，但至少应每3个月进行一次，具体方法如下：一般维护可用中性洗涤剂清洁，或者用60%的异丙醇，然后用蒸馏水反复洗涤，去除洗涤剂或异丙醇，晾干。清洁后，在活塞处可使用一定量的润滑剂。如果有液体进人加样器内的严重污染，可将加样器拆开后进行清洁，具体拆开步骤可参照可调式移液器说明书操作。 三、液体的混匀 在生物化学与分子生物学实验中，除特殊情况外，一般每加一个试剂后，都要随时混勻，以保证反应充分进行，不混勻则往往影响实验结果。下面简单介绍几种混勻液体的方法，可根据使用器皿的液体容量而选用。 1.旋转混匀法手持容器作离心旋转，适用于未盛满液体的试管或小口器皿，如三角瓶等。