现代生物学仪器分析

**章 绪论　　科学上的发现和技术上的发明是从对事物的观察开始的，对事物的精细观察就要借助于科学仪器，特别是自然科学和工业生产领域。科学仪器是开展科学研究和实现发明创造的必要手段，是认识世界的工具。科学发展史一再证明，许多重要科学分支的确立和发展归功于重要的科学仪器装置的研制成功。极谱仪的发明产生了极谱学，色谱仪的发明产生了色谱学，光谱仪的发明产生了光谱学，质谱仪的发明产生了质谱学，而扫描隧道显微镜的发明对纳米科技的兴起和发展起到决定性作用。　　随着现代科学技术的不断进步以及交叉边缘新兴学科的不断涌现，相关新的生物分析方法已经成为非常热门的研究课题。生命科学领域的发展与仪器分析的发展息息相关。现代生物学仪器分析技术是一门具有前沿性和发展潜力的交叉学科，涉及电子学、物理学、计算机科学、化学、激光技术等多门学科与技术领域。随着现今科学技术的飞速发展，新的分析仪器和分析方法不断地被创造出来。这些仪器在生物科学、医学、环境科学、药学、材料科学、物理学等领域得到广泛的应用，现代生物学仪器分析技术已成为学科相互渗透的重要手段之一。　　**节 仪器分析概述　　一、仪器分析的任务　　仪器分析（instrumental analysis）是以物质的物理或化学性质为基础，探求这些性质在分析过程中所产生的信号与物质结构、组成的内在关系和规律，进而对其进行定性、定量、结构和形态分析的一类分析方法。由于这类方法常用到各种比较复杂、精密或特殊的仪器设备，故称为仪器分析。　　仪器分析是20世纪40年代发展起来的一类分析方法，是化学学科的重要分支，通过使用仪器测定物质的一些物理和化学特性，获得物质的组成、含量、结构及形态等相关信息，通过使用一些高效的仪器分离分析技术如高效色谱仪，可以取代传统的层析对复杂混合物的分离，可直接进行定性、定量分析。这些分离、分析、检测方法，构成了仪器分析方法。仪器分析是生物科学、食品科学、中药学、药学、药物制剂、环境科学等专业的专业基础课之一。　　二、仪器分析的特点　　与经典的化学分析相比，仪器分析具有如下特点。　　（1）灵敏度高：仪器分析的*低检出量大大降低，由化学分析的10-6g降至10-12g，甚至更低，适用于微量、痕量和超痕量成分的分析。例如，原子吸收分光光度法测定某些元素的绝对灵敏度可达10-14g，电子光谱甚至可达10-18g。　　（2）分析速度快：仪器分析操作简便、快速、重现性好，易于实现自动化、信息化和在线检测，适于批量样品的分析。许多仪器配有自动进样装置和微计算机控制系统，能在较短时间内分析多个样品，满足生产控制的需要，如发射光谱分析法在1min内可同时测定水中48种元素。　　（3）试样用量少：仪器分析的样品用量由化学分析的毫升、毫克级降低至微升、微克级，甚至更低，适合于微量、半微量乃至超微量分析。　　（4）可进行无损分析：很多仪器分析方法可在物质的原始状态下使用，实现试样非破坏性分析及表面、微区、形态等分析，测定后试样可回收，适合于活体分析和考古、文物等特殊领域的分析。　　（5）选择性高：很多仪器分析方法可通过选择或调整测定条件，使共存的组分测定时相互间不产生干扰，尤其适合于中药等复杂体系的分析。实现复杂混合物的成分分离、分析和结构测定。　　（6）用途广泛：仪器分析除进行定性、定量分析外，还能进行结构分析、物相分析、微区分析、价态分析及测定分子量、稳定常数等操作，能适应各种分析的要求。　　（7）分析成本高：仪器分析通常需要结构复杂、价格昂贵的仪器设备，分析成本一般比化学分析高，且对环境、维护和操作者的要求较高。　　三、仪器分析方法的分类　　仪器分析的方法根据测量物质的性质进行分类。通常包括：电化学分析法、光学分析法、色谱分析法和其他仪器分析法。　　1. 电化学分析法　　电化学分析法（electrochemical analysis）是根据物质在溶液中的电化学性质建立的一类分析方法。以电信号作为计量关系的一类方法，主要包括：电导分析法、电位分析法、库仑分析法、伏安分析法、极谱分析法等。　　2. 光学分析法　　光学分析法（optical analysis）是根据物质发射的电磁辐射或电磁辐射与物质的相互作用而建立起来的一类分析化学方法，可分为光谱法和非光谱法。光谱法是基于物质与辐射能作用时，测量由物质内部发生量子化的能级之间的跃迁而产生的发射、吸收或散射辐射的波长和强度进行分析的方法。非光谱法是基于物质与辐射相互作用时，测量辐射的某些性质，如折射、散射、干涉、衍射、偏振等变化的分析方法。　　光谱法可分为原子光谱法和分子光谱法。原子光谱法是由原子外层或内层电子能级的变化产生的，它的表现形式为线光谱。属于这类分析方法的有原子发射光谱法（AES）、原子吸收光谱法（AAS）、原子荧光光谱法（AFS）、X射线荧光光谱法（XFS）等。分子光谱法是由分子中电子能级、振动和转动能级的变化产生的，表现形式为带状光谱。属于这类分析方法的有紫外可见分光光度法（UV Vis）、红外光谱法（IR）、分子荧光光谱法（MFS）和分子磷光光谱法（MPS）等。　　3. 色谱分析法　　色谱分析法（chromatographic analysis）是利用混合物中的各组分在互不相溶的两相（固定相与流动相）中的吸附、分配、离子交换等性能方面的差异进行分离分析测定的一类分析方法。色谱分析法主要包括气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱法（TLC）和离子色谱法（IC）等。此外，还有新近发展起来的超临界流体色谱（SFC）和毛细管电泳技术（CE），也属于色谱分析的范畴。　　4. 其他分析法　　除以上三类分析方法外，还有利用热学、力学、声学、动力学等性质进行测定的仪器分析法。其中*主要的有以下三种。　　（1）质谱法（MS）：根据物质带电粒子的质荷比在电磁场作用下进行定性、定量和结构分析的方法。　　（2）热分析法：依据物质的质量、体积、热导、反应热等性质与温度之间的动态关系来进行分析的方法。　　（3）放射分析法：依据物质的放射性辐射来进行分析的方法如同位素稀释法、中子活化分析法等。　　第二节 现代生物学仪器分析　　一、现代生物学仪器分析概述　　生命科学研究的发展，需要对多肽、蛋白质、核酸等生物大分子进行观察分析，对生物药物进行定性定量分析，对超微量生物活性物质（如单个细胞内神经传递物质）进行分析以及对生物活体等进行观察和分析。我国在发展高技术战略的规划中，也把生物技术列为重点领域。生命科学及生物工程的发展向仪器分析提出了新的挑战。当前电泳技术、离心技术、色谱、质谱、磁共振、荧光、化学发光和免疫分析以及化学传感器、生物传感器、化学修饰电极和生物电分析化学等为主体的各种分析手段，广泛应用于生命体与有机组织及分子和细胞水平上，以研究生命过程中某些大分子及生物活性物质的化学和生物本质。现代生物学仪器分析是在仪器分析基础上产生的一个崭新而年轻的领域，它是以化学和物理信息学为基础，交叉融合了生物学的一门综合性学科。　　二、生物学仪器分析的应用成果　　纵观科学研究的重大历史突破，有许多重大研究成果是科学家因应用仪器分析研究生物科学现象而获得的。Kurt Wuthrich教授因发现应用磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构的新方法而获得了2002年诺贝尔化学奖。磁共振可提供分子空间立体结构的信息，目前已经发展成为分析分子结构和研究化学动力学的重要手段，在有机化学、生物化学、药物化学等领域得到了广泛的应用，这反映出了磁共振技术的迅猛发展及其对前沿研究工作的巨大贡献。日本科学家田中耕一和美国科学家John Fenn共同开发出生物大分子的质谱分析技术，发展了基质辅助激光解析电离法，为发展生物大分子的鉴定与结构分析方法做出了重大贡献，获得了2002年诺贝尔化学奖。瑞典皇家科学院称赞他们的研究工作“提升了人类对生命进程的认识”。傅里叶变换红外光谱（FTIR）可提供有关分子结构的多种信息，辅以二阶导数、去卷积、曲线拟合等解析方法可以研究蛋白质二级结构的变化规律。近几年，应用FTIR 从分子水平的角度研究癌症是生物医学领域的热门课题。癌组织和正常组织的谱图表明癌组织样品与正常样品的红外光谱存在明显差异，通过谱图解析可直接或间接地阐明引起谱图变化的主要原因，以及细胞癌变的可能机制和病程进展。在对生物大分子的分析中，生物质谱与其他分析方法相比，准确性和灵敏度高，速度快，易于大规模和高通量操作，因此在基因组学和蛋白质组学研究中扮演着越来越重要的角色。例如，在蛋白分析技术中生物质谱以其不可比拟的优越性能，已经成为蛋白质组学研究中必不可少的技术平台，在蛋白质鉴定、序列分析、定量、翻译后加工（修饰）及蛋白质相互作用等方面得到了广泛的应用，其中，用于蛋白序列分析的生物质谱鉴定方法有基质辅助激光解吸飞行时间肽质量指纹谱（MALDI-TOF-PMF）、串联质谱的肽序列标签以及肽段的从头测序。　　三、现代生物学仪器分析的发展趋势　　现代生物学仪器分析技术正向智能化方向发展，发展趋势主要表现为：基于微电子技术和计算机技术的应用实现分析仪器的自动化，通过计算机控制器和数字模型进行数据采集、运算、统计、处理，实现了分析仪器数字图像处理能力的发展。分析仪器的联用技术向测试速度超高速化、分析试样超微量化、分析仪器超小型化的方向发展。　　重点研究方向包括：一是高通量分析，即在单位时间内可分析测试大量的样品；二是极端条件分析，其中单分子单细胞分析与操纵为目前热门的课题；三是在线、实时、现场或原位分析，即从样品采集到数据输出，实现快速的或一条龙的分析；四是联用技术，即将两种或两种以上分析技术连接，互相补充，从而完成更复杂的分析任务。联用技术及联用仪器的组合方式，特别是二联甚至是三联系统的出现，已成为现代分析仪器发展的重要方向；五是阵列技术，如果把联用分析技术看成计算机中的串行方法，那么阵列技术就等同于计算机中的并行运算方法。阵列方法是大幅度提高分析速度或样品批量处理量的*佳方案。一旦将并行阵列思路与集成和芯片制作技术完美结合，仪器分析技术就将向新的领域进发。　　现代生物学仪器分析是在细胞和分子水平研究生命过程、生理、病理变化和药物代谢、基因改造的有力工具，是生物大分子多维结构和功能研究、疾病预防与诊断、药品与食品安全保障的常用技术。　　第二章 电泳技术　　利用带电粒子在电场中的移动速度不同而使混合物分离的技术称为电泳技术。电泳技术是一种先进的分离检测手段，与其他先进技术相配合，能创造出惊人的成果，可使人们用较少代价获得*优效益。因此电泳技术正越来越多地为人们所重视，广泛应用于各个领域。本章在醋酸纤维素薄膜电泳和以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的凝胶电泳技术的基础上介绍等电聚焦电泳和双向电泳。　　**节 等电聚焦电泳　　等电聚焦电泳（isoelectric focusing，IEF）是20世纪60年代由瑞典科学家H.Rilbe和O.Vesterberg建立的一种高分辨率的蛋白质分离和分析技术。它的分离原理是利用蛋白质分子或其他两性电解质分子具有不同的等电点，从而在一个稳定、连续、线性的pH梯度中得到分离。近年来，等电聚焦电泳技术的分辨率有了很大提高，可以分辨pI（等电点）只差0.001的生物大分子，这是等电聚焦*突出的优点，且重复性好，样品容量大，只需要一般的电泳设备，操作更加简便快速，这些优点使等电聚焦技术得到广泛应用。　　一、等电聚焦电泳的基本原理　　由于各种蛋白质的氨基酸组成不同，因此有不同的等电点。当pH>pI时，蛋白质带负电荷，在电场的作用下向正极移动；当pH<>　　等电聚焦电泳技术就是在电泳支持介质中加入载体两性电解质（carrier ampholytes），通以直流电后在正负极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，正极附近是低pH区，负极附近是高pH区。蛋白质在pH梯度凝胶中，当大于或小于其等电点时仍带电荷，因此，蛋白质在pH梯度凝胶中受电场力作用能进行电迁移，但在pH梯度凝胶中，当pH等于蛋白质等电点时，蛋白质就失去电荷而停止运动。蛋白质在凝胶中迁移的距离取决于其本身的等电点的大小，当蛋白质分子一旦到达pH等于其等电点的位置，分子所带净电荷为0，就不能再迁移。如果它向等电点两侧扩散，净电荷就不再为0，又会被阴极或阳极吸引回来，直至回到净电荷为0的位置，因此蛋白质在与其本身pI相等的pH位置被聚焦成窄而稳定的区带（图2-1）。这种效应称为“聚焦效应”，保证了蛋白质分离的高分辨率，