气相色谱分析及应用(第三版)

第1章　绪论 1.1　色谱发展简史 按照国际纯粹与应用化学联合会（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）的定义，色谱法（chromatography）是指样品组分在固定相和流动相两相间进行分配的物理分离过程。 有人以蜜蜂和马蜂为例形象地描述色谱分离过程。色谱分离过程就像是一群蜜蜂和马蜂在一定方向和速度的风的推动下同时通过一个开满鲜花的花坛，行进中的蜜蜂不时地停落在鲜花上采蜜，而对鲜花不感兴趣的马蜂则不停地飞行，因此马蜂与蜜蜂逐渐拉开距离而分开。在这个例子中，花坛中的鲜花相当于色谱的固定相，按一定方向和速度流动的风相当于色谱的流动相，蜜蜂采蜜过程相当于色谱过程中组分与固定相之间的分子相互作用。 俄国植物学家茨维特（Tswett，1872—1919年）是色谱法的创始人[1]。茨维特*先采用柱层析法对植物色素提取物进行了分离，并首次提出了色谱的概念。1903 年 3 月，茨维特在华沙自然科学学会生物分会会议上做了题为On a new category of adsorption phenomena and their application to biochemical analysis的报告，介绍了一种成功用于植物色素分离的新吸附技术。此后，茨维特又进一步完善了该方法，在1906年先后发表的两篇论文[2]中详细介绍了植物色素的分离方法。论文中有一段被广泛引用的叙述，原文为“Like light rays in the spectrum，the different components of a pigment mixture，obeying a law，are resolved on the calcium carbonate column and then can be qualitatively and quantitatively determined. I call such a preparation a chromatogram and the corresponding method the chromatographic method.”。 图1-1是茨维特在1906年发表的论文中给出的色谱分离装置。在填装有吸附剂碳酸钙的玻璃管上表面，加入植物叶子的石油醚提取物，然后用石油醚洗脱。在洗脱过程中，吸附剂柱上逐渐形成了不同颜色的色带。 遗憾的是，茨维特的论文在发表后的25年中并没有引起人们的关注。直到1931年，奥地利化学家库恩（Kuhn，1900—1967年）等发现了茨维特的吸附色谱法（adsorption chromatography）的重要性，并应用和发展了茨维特的色谱法。库恩利用茨维特的液-固色谱法，将氧化铝和碳酸钙作为吸附剂首次分离出三种胡萝卜素异构体（α-，β-和γ-胡萝卜素）结晶。之后，库恩又分离出60多种类胡萝卜素并测定了分子式。后来，库恩及其合作者又将液-固吸附色谱法成功用于叶黄素和维生素等的研究，极大地促进了液-固吸附色谱法的应用和发展。鉴于其在研究类胡萝卜素和维生素等方面取得的显著成就，库恩在1938年被授予诺贝尔化学奖。 图1-1　茨维特的色谱分离装置 （a）可同时使用五根色谱柱的装置（其中看似分液漏斗的下端为填充柱，内径为2～3mm，长度为20～30mm）； （b）大样品量使用的装置（内径为1～3cm，填充长度为5～9cm）；（c）茨维特绘制的植物色素分离色谱图 20世纪40年代，色谱法得到了快速发展。1941年6月在英国生物化学会会议上，两位英国青年化学家马丁（Martin，1910-2002年）和辛格（Synge，1914-1994年）报告了一种新型液-液分配色谱法。他们用硅胶吸附的水作固定相，以氯仿作流动相，成功地分离了羊毛中的氨基酸。该报告及其随后发表在生物化学杂志上的论文标志着分配色谱（partition chromatography）的诞生。1952年，他们因在分配色谱法方面的突出贡献获得了诺贝尔化学奖。马丁和辛格提出了色谱塔板理论并预言气体可代替液体作为流动相。1977年3月，英国邮政出版了四枚纪念英国在化学领域取得成就的邮票，其中一枚是为纪念马丁和辛格在1952年获得诺贝尔化学奖。 1952 年，马丁与另一位年轻的科学家詹姆斯（James）发表了一篇在分配色谱方面取得重要突破的论文，采用以气体为流动相的气-液分配色谱（gas-liquid partition chromatography，GLPC）分离挥发性脂肪酸。文中以硅藻土（celite）为载体，硅油为固定相，气体为流动相。该研究标志着气-液分配色谱的诞生。在随后的几个月里，他们又连续发表了两篇论文，在分析化学领域产生了重要影响。1952 年9 月，在牛津召开了**次国际分析化学会议，有来自26个国家的700多人参会。马丁介绍了气相色谱（gas chromatography，GC）这一新技术，引起了与会者的极大兴趣。此次会议极大地推动了气相色谱的发展和应用。 1956年，荷兰学者范第姆特（van Deemter）等发展了另一重要的色谱理论，即速率理论（rate theory）。该理论从动力学角度描述了填充柱气相色谱法的色谱过程，阐明了气-液色谱法（gas-liquid chromatography，GLC）中溶质扩散和传质过程。 1957 年，戈雷（Golay）在由美国仪器学会举办的**届气相色谱会议上发表了一篇有关开管柱气相色谱法（open-tubular column gas chromatography）（现常称为毛细管气相色谱法，capillary gas chromatography）的报告。该报告标志着毛细管气相色谱的开端。在此后的一段时间里，戈雷等研究了毛细管柱的制备方法，并进一步完善了毛细管柱色谱理论。1958年，在阿姆斯特丹召开的国际气相色谱会议上，戈雷提出了著名的戈雷方程（Golay equation），阐述了各种参数对色谱柱分离性能的影响，奠定了毛细管色谱发展的基础，并极大促进了毛细管柱制柱技术和相关仪器的发展和应用。 毛细管色谱柱的材料也逐渐由*初的不锈钢柱发展到玻璃柱，*后发展到目前广泛采用的弹性熔融石英毛细管柱（flexible fused-silica capillary column）。熔融石英毛细管柱的出现是气相色谱的又一次革命。1979年春，在第三届毛细管色谱国际会议上，Dandeneau和Zerenner首次报告了对熔融石英毛细管柱的研究，开始了熔融石英毛细管柱的时代。 随着气相色谱法的发展，人们开始将类似的条件用于液相色谱（liquid chromatography，LC）的研究工作，其中Giddings等做出了重要贡献。1963年，Giddings发表的题为“类似气相色谱操作条件的液相色谱法”的论文引发了液相色谱法的一场革命。与之前的依靠低压或重力分离（如茨维特的柱层析法）的液相色谱法不同的是，该新型液相色谱法需使用高压泵，因此称为高压液相色谱法（high-pressure liquid chromatography，HPLC）。随着相关技术的快速发展，后来又称为高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，HPLC）。在之后的几年里，Giddings对相关的色谱理论进行了总结和扩展，并于1965年出版了《色谱动力学》（Dynamics of Chromatography）专著[9]。此后，速率理论成为色谱理论的一个重要组成部分。色谱发展中的一些标志性进展见表 1-1。 1.2　色谱法分类 色谱法的种类和名称各异。基于色谱分离规模、流动相和固定相的形态、色谱分离载体的形状、色谱分离机理等，色谱法主要分为以下各类方法。 1.2.1　按照色谱分离规模分类 按照色谱分离规模，色谱法分为分析型和制备型。分析型色谱主要用于样品组分的定性和定量分析；而制备型色谱主要用于样品中目标组分的分离和纯化，以获得纯品为目的。根据制备样品量的大小，制备型色谱又分为实验室制备型色谱、中试制备型色谱、生产制备型色谱等。各种色谱规模的组分质量和所需色谱柱内径的大致范围见表1-2。本书内容只涉及分析型色谱。 1.2.2　按照流动相和固定相的形态分类 按照流动相的形态，色谱法分为气相色谱法和液相色谱法；前者的流动相为气体（常称为载气）；后者的流动相为液体。此外，还可以超临界流体作为流动相，称为超临界流体色谱（supercritical fluid chromatography，SFC）。超临界流体是指物质在高于临界温度和临界压力时的一种状态，不是气体也不是液体但兼具气体和液体的某些性质，如气体的低黏度、液体的高密度和介于气、液之间较高的扩散系数等特性。这种流体因其密度不同，对各种物质具有不同的溶解能力。目前SFC常用的超临界流体是二氧化碳和氧化亚氮，常用的固定相是固体吸附剂（如硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物。SFC是GC和LC的补充，SFC可以分析不挥发性组分，具有比液相色谱更高的分析效率。 按照固定相的形态，色谱法分为吸附色谱法和分配色谱法。在色谱分析条件下，前者的固定相为固态（常称为吸附剂）；后者的固定相为液态（常称为固定液）。色谱法按照流动相和固定相的形态分类见表1-3。 1.2.3　按照色谱分离载体的形状分类 按照色谱分离载体的形状，色谱法分为平面色谱和柱色谱。前者的载体为玻璃板或滤纸（如薄层色谱、纸色谱等），后者的载体可为玻璃柱、不锈钢柱、毛细管柱等（如柱层析、气相色谱、液相色谱、毛细管电色谱等）。 1.2.4　按照色谱分离机理分类 按照色谱分离机理或分子间作用，色谱法分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱等（图1-2），此外，还有亲和色谱等。被分离组分与固定相间分子作用不同，色谱分离机理则不同。 图1-2　不同分离机理的色谱法示意图 图中箭头为流动相流动方向 分配色谱的分离是基于样品各组分在两相间分配系数的差异。当组分在固定相中的溶解度大于其在流动相中的溶解度时，其分配系数大、保留时间长；反之分配系数小、保留时间短。因此，在一定色谱条件下，各组分因分配系数的差异而具有不同的保留时间，使各组分得到分离。 在液相色谱中，当固定相极性大于流动相极性时，称为正相色谱（normal- phase chromatography）；当固定相的极性小于流动相的极性时，称为反相色谱（reversed-phase chromatography）。例如，当固定相为硅胶，流动相为己烷/甲醇（90∶10）时，此时固定相极性大于流动相极性，为正相色谱；当固定相为十八烷基键合硅胶，流动相为水/乙腈（90∶10）时，此时固定相极性小于流动相极性，为反相色谱。 吸附色谱的分离是基于组分在固态吸附剂表面吸附系数的差异。被固定相吸附作用强的组分，其色谱保留时间长。 离子交换色谱主要用于无机离子和有机离子的分离。离子交换分离与所用固定相的离子类型（阳离子、阴离子、电荷数等）有关。 尺寸排阻色谱的分离是基于组分分子的大小和形状。分子较大的组分不能进入固定相孔隙结构内部，很快随流动相流出，保留时间短；而分子较小的组分因可进入孔隙结构内，保留时间较长。因此，通过尺寸排阻色谱可将不同大小或不同形状的组分分子分开。本法常用于测定聚合物的分子量分布；也可用于样品预处理，去除样品基质中的大分子干扰物，如食品、蔬菜、水果中的纤维、色素等。 1.3　色谱法的特点、应用领域和发展趋势 色谱法具有以下特点： （1）具有强大的组分分离、定性和定量功能，