基因工程实验项目化教程

项目一基因工程实验安全及防护 001
【学习目标】 001
【项目说明】 001
【基础知识】 001
（一）基因工程概述 001
（二）基因工程实验安全及生物安全操作规范 005
【项目实施】 010
任务1-1基因工程实验常用的有毒化学试剂及其防护 010
任务1-2掌握基因工程实验常见仪器设备的操作规程和注意事项 014
任务1-3基因工程实验生物危害废品的处理 019
【能力拓展】 021
（一）火灾及预防 021
（二）触电及急救 026
【实践练习】 032

项目二基因工程实验常用溶液及培养基配制 034
【学习目标】 034
【项目说明】 034
【基础知识】 034
（一）化学试剂的规格和生物试剂的分类 034
（二）溶液浓度的表示、调整和互换 036
（三）溶液的配制 038
（四）生物实验室玻璃器皿的洗涤 042
【项目实施】 044
任务2-1移液器的使用与维护 044
任务2-2配制常用溶液和抗生素 048
任务2-3常用细菌培养基及配制 052
【能力拓展】 055
（一）常用酵母培养基 055
（二）试剂盒 057
（三）体外诊断试剂 059
【实践练习】 062

项目三大肠杆菌基因组DNA的制备 063
【学习目标】 063
【项目说明】 063
【基础知识】 063
（一）核酸的理化性质 063
（二）核酸的分离提取原理 067
（三）核酸的固相提取方法 071
【项目实施】 073
任务3-1制备大肠杆菌基因组DNA的操作准备 073
任务3-2SDS法制备大肠杆菌基因组DNA 076
任务3-3CTAB法制备大肠杆菌基因组DNA 079
任务3-4煮沸法制备大肠杆菌基因组DNA 082
【能力拓展】 083
（一）动物基因组DNA的提取 083
（二）植物基因组DNA的提取 085
（三）酵母基因组DNA的提取 085
（四）总RNA和mRNA的提取 086
【实践练习】 088

项目四PCR扩增大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ基因（ansB） 089
【学习目标】 089
【项目说明】 089
【基础知识】 090
（一）目的基因的分离制备 090
（二）聚合酶链式反应 092
（三）PCR引物设计 095
（四）降落PCR 100
（五）PCR技术的应用 101
【项目实施】 101
任务4-1操作准备 101
任务4-2L-天冬酰胺酶Ⅱ基因（ansB）引物设计 106
任务4-3PCR扩增L-天冬酰胺酶Ⅱ基因（ansB） 110
任务4-4降落PCR优化L-天冬酰胺酶Ⅱ基因（ansB）扩增退火温度 112
【能力拓展】 114
（一）实时荧光定量PCR 114
（二）菌落PCR 122
（三）常用核酸序列数据库 123
【实践练习】 125

项目五质粒pET-28a的制备 126
【学习目标】 126
【项目说明】 126
【基础知识】 126
（一）质粒 127
（二）pET系列质粒 130
（三）质粒DNA的提取方法 132
（四）琼脂糖电泳鉴定质粒DNA 134
（五）质粒DNA浓度和纯度检测 135
【项目实施】 135
任务5-1操作准备 135
任务5-2SDS碱裂解法小量制备质粒pET-28a 137
任务5-3SDS碱裂解法大量制备质粒pET-28a 141
任务5-4少量提取质粒pET-28a的简易方法 142
任务5-5煮沸裂解法快速提取质粒pET-28a 144
【能力拓展】 145
（一）酵母表达载体 145
（二）质粒图谱的绘制 147
（三）质粒资源的获取方式 151
【实践练习】 155

项目六琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA、PCR产物及质粒pET-28a 157
【学习目标】 157
【项目说明】 157
【基础知识】 157
（一）电泳 157
（二）琼脂糖凝胶电泳 158
（三）核酸电泳的指示剂与染色剂 161
（四）核酸电泳的DNA分子量标记 163
【项目实施】 165
任务6-1操作准备 165
任务6-2琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA、质粒pET-28a及PCR产物 166
任务6-3PCR扩增产物的纯化回收 172
【能力拓展】 174
（一）新型核酸荧光染料 174
（二）脉冲场凝胶电泳 177
（三）双相电泳 179
（四）微型凝胶电泳 180
【实践练习】 181

项目七L-天冬酰胺酶Ⅱ基因（ansB）和质粒pET-28a的酶切与连接 182
【学习目标】 182
【项目说明】 182
【基础知识】 182
（一）核酸工具酶及主要功能 182
（二）限制性内切核酸酶 183
（三）DNA连接酶 186
（四）重组DNA分子的构建 188
【项目实施】 188
任务7-1操作准备 188
任务7-2目的基因ansB和质粒pET-28a的双酶切 189
任务7-3目的基因ansB和质粒pET-28a酶切产物的检测、纯化和回收 191
任务7-4目的基因ansB和质粒pET-28a的连接 193
【能力拓展】 195
（一）DNA甲基化酶及其它工具酶 195
（二）Ⅱ型限制性内切核酸酶的几种特殊类型 196
（三）目的基因片段与载体分子的连接方法 197
（四）末端转换常用的方法和使用的主要工具酶 198
【实践练习】 199

项目八将重组质粒pET-28a-ansB转化至大肠杆菌BL21 200
【学习目标】 200
【项目说明】 200
【基础知识】 201
（一）细菌自然转化 201
（二）重组 DNA分子的转化 203
（三）受体细胞与感受态 205
【项目实施】 206
任务8-1操作准备 206
任务8-2大肠杆菌BL21感受态细胞的制备 208
任务8-3用热激法将重组质粒pET-28a-ansB导入大肠杆菌BL21 210
任务8-4用电穿孔法将重组质粒pET-28a-ansB导入大肠杆菌BL21 212
【能力拓展】 214
（一）重组DNA转化至酵母的方法 214
（二）重组DNA转化至动物细胞的方法 215
（三）转基因技术 217
【实践练习】 219

项目九重组子的鉴定及ansB基因表达产物分析 220
【学习目标】 220
【项目说明】 220
【基础知识】 220
（一）重组子的筛选与鉴定 220
（二）目的基因在宿主细胞中的表达 224
（三）基因表达产物的电泳分析及酶活检测 226
【项目实施】 229
任务9-1操作准备 229
任务9-2重组菌中ansB基因的诱导表达和粗提取 231
任务9-3基因表达产物的SDS-PAGE检测 232
任务9-4基因表达产物的酶活检测 235
【能力拓展】 236
（一）蛋白质工程 236
（二）大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ的结构与改造 238
（三）重组菌L-天冬酰胺酶Ⅱ的纯化策略 241
【实践练习】 242

参考文献 244