园艺分子生物学实验技术(创新型现代农林院校研究生系列教材科学出版社十三五普通高等教育研究生规划教材)

第1章 核酸分离提取技术 1.1 脱氧核糖核酸（DNA）的分离提取 1.1.1 实验目的 脱氧核糖核酸（ DNA）作为生命的遗传物质，其双螺旋结构的发现对生物学具有里程碑的意义，不仅使生命科学进入分子生物学的时代，而且使生物技术得到更好的发展完善。当今的生物学可以进行从一个基因到一个基因家族的研究，进一步到宏观的基因组学研究。 DNA提取在植物生物化学研究中至关重要，基因分离与功能研究、遗传转化体系建立研究、转基因研究、基因作用机理研究及分子标记等都以 DNA的提取为前提。因此，有效分离提取高质量的植物 DNA是植物基因工程研究的基础。 植物组织含有较多的次生代谢产物如酚类、萜类、色素和多糖，这些物质给 DNA的分离、提取与纯化带来较多的困难，影响了 DNA分析与基因研究的结果。在动植物 DNA的研究过程中，科研人员相继探索出十二烷基硫酸钠（ SDS）法、氯化铯法等 DNA分离方法，但存在成本高、污染大且效率低等缺点。在众多的 DNA提取方法中， CTAB法具有成本低、效率高、操作便捷等特点，逐渐成为植物 DNA提取的常用手段。本节以葡萄叶片为材料，以 CTAB法为例，通过介绍 DNA提取的原理与步骤，详细阐述 DNA的分离提取和纯化技术，其目的是了解 DNA分离提取的技术原理，掌握操作流程。 1.1.2 实验原理 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法的原理是首先裂解植物细胞，释放植物 DNA，进而利用有机溶剂进行多次抽提，使蛋白质、多糖等变性沉淀，色素等有机物保留在有机溶剂中，而 DNA保留在水相中，昀终分离得到较纯净的 DNA。不同的 DNA提取方法、提取效率不同。在琼脂糖凝胶电泳中根据 DNA条带的亮度和清晰度可判断 DNA的产量、质量及完整性。在植物 DNA的提取过程中， CTAB的作用主要有两点：①破坏植物细胞膜，将植物 DNA从细胞中释放到缓冲液中；②与多糖和蛋白质结合，使蛋白质变性，有利于 DNA与变性蛋白质及多糖的分离。通过这两个特性，达到提取和分离 DNA的目的。乙二胺四乙酸（ EDTA）是二价金属离子的螯合剂，可螯合溶液中的 Mg2＋、Ca2＋，抑制 DNase酶对 DNA的降解作用。 Tris-HCl是常用的缓冲溶液，可使得 DNA稳定存在于适宜 pH的缓冲环境中。聚乙烯吡咯烷酮（ PVP）和 β-巯基乙醇可防止植物细胞中的酚类物质氧化成醌类物质，防止它们与 DNA不可逆地结合，干扰提取分离效果。氯仿∶异戊醇可以溶解溶液中的色素，使蛋白质进一步变性析出并与 DNA分离，其中异戊醇作为消泡剂，可以使有机相与水相充分混刀。在高盐溶液——乙酸钠溶液中，离子键切断 DNA与蛋白质等大分子的结合，而且乙酸钠溶液中的 Na＋可中和 DNA分子所带的负电荷，消除 DNA分子间的静电斥力，防止其他大分子化合物与 DNA的结合。乙醇携带的羟基可以与 DNA分子上的 H＋结合，使 DNA分子脱水，疏水基团裸露出来，促使 DNA析出。 1.1.3 实验用品 1．材料新鲜幼嫩的葡萄叶片。 2．仪器和用具研钵、水浴锅、2mL离心管、 15mL离心管、容量瓶、涡旋仪、离心机、电泳仪、凝胶成像仪、紫外分光光度计、冰箱、移液器等。 3．试剂 1）CTAB提取液：将 4g CTAB、16.364g NaCl、20mL 1mol/L Tris-HCl（pH8.0）、8mL0.5mol/L EDTA加入约 70mL的 ddH2O中，定容至 200mL并高温灭菌。 2）20% PVP（聚乙烯吡咯烷酮）：取 20g PVP粉末用 ddH2O充分溶解，定容至 100mL并高压灭菌。 3）氯仿∶异戊醇（24∶1，V/V）：96mL氯仿（三氯甲烷）加 4mL异戊醇混刀。 4）75% 乙醇（ V/V）：75mL无水乙醇与 25mL ddH2O混合。 5）Tris-HCl溶液（ 1mol/L，pH8.0）：将 31.528g Tris-HCl溶于 200mL ddH2O中，调节 pH为 8.0后高温灭菌。 6）EDTA溶液（ 0.5mol/L，pH8.0）：将 18.61g Na2EDTA 2H2O与 2g NaOH粉末溶于 100mL ddH2O中，调节 pH为 8.0。 7）1×TE溶液（ pH8.0）：取 1mol/L Tris-HCl（pH8.0）1mL，0.5mol/L EDTA（pH8.0）0.2mL，加 ddH2O定容至 100mL。 8）乙酸钠溶液（3mol/L，pH5.2）：取 408.1g的三水合乙酸钠溶解于约 800mL ddH2O中，用冰醋酸调节 pH至 5.2，并定容到 1L。高压灭菌后室温保存。 9）乙酸铵溶液（1mol/L，pH4.5）：乙酸铵 7.7g，加 50mL水溶解后，加冰醋酸调 pH至 4.5，需用冰醋酸约 6mL，用 ddH2O定容至 100mL。 10）5×TBE电泳缓冲液母液：取 54g Tris，27.5g硼酸（ boric acid），0.5mol/L EDTA（pH8.0）20mL，加水定容至 1000mL。工作液为 0.5×TBE，使用时用蒸馏水稀释 10倍。 11）其他试剂：无水乙醇、氯仿∶辛醇（ 24∶1）混合液、聚乙烯聚吡咯烷酮（ PVPP）、 RNase、β-巯基乙醇、 5mol/L NaCl、核酸染料、液氮、琼脂糖等。 1.1.4 操作步骤 1．植物 DNA的分离提取（ CTAB法） 方法一 1）预热 CTAB提取液（ 65℃水浴）：配制后的 CTAB提取液放置时间长会有晶体析出，可 65℃加热溶解。 2）取约0.1g新鲜幼嫩的葡萄叶片在研钵中用液氮快速研磨至粉末。 3）将粉末转移至2mL无菌离心管中，快速加入 750μL CTAB提取液、20μL β-巯基乙醇、100μL PVP溶液（20%）并涡旋振荡至充分混刀。 4）在 65℃水浴 30min，其间每隔 10min颠倒混刀一次。 5）加入与上清液等体积（约 700μL）的氯仿∶异戊醇（ 24∶1），充分混刀。 6）12 000r/min下离心 10min，将上清液转移至新的 2mL无菌离心管中。 7）加入等体积（约700μL）的氯仿∶异戊醇（ 24∶1），充分混刀。 8）12 000r/min下离心 10min，小心吸取上清液至新的 2mL无菌离心管中。 9）加入2倍体积的无水乙醇上下颠倒混刀，室温下静置 30min。 10）用吸头将白色絮状 DNA挑取至干净的 2mL无菌离心管中，加 1mL 75%乙醇清洗 DNA 2次。 11）将乙醇溶液倒掉，晾干，使乙醇彻底挥发，加入 200μL 1×TE充分溶解 DNA。方法二 为便于实验操作，可简化实验步骤，参照 Doyle（1987）的方法略加修改如下： 1）新鲜幼嫩的葡萄叶片 0.5g置于研钵中，加入 5mL液氮，研磨成细粉状，待解冻后加入 5mL CTAB提取液。研磨成均刀的混合液后，转入 15mL离心管中，置于 65℃水浴锅中水浴 30min。 2）取出离心管，置于室温下冷却；加入 50mg聚乙烯聚吡咯烷酮（ PVPP）和等体积的氯仿∶辛醇混合液（ 24∶1），摇刀后，在 8000r/min下离心 10min。 3）将上清液移入另一洁净的 15mL离心管中，加入 5mol/L NaCl 2mL后，再加入 2倍体积预冷的无水乙醇（ 0℃），轻轻混刀，置入－20℃冰箱中 1h或过夜。 4）挑出似棉絮状的小团，用乙酸钠/乙醇溶液（10mmol/L乙酸钠，76%乙醇）洗涤30min后，在 10mmol/L乙酸铵中洗涤 30s，提取的 DNA溶于 200μL的 TE溶液［10mmol/L Tris（pH8.0），250mmol/L EDTA］中备用。 5）DNA浓度用 1%琼脂糖凝胶电泳估测，电极缓冲液用 TBE［10.8g Tris（pH8.0），5.5g硼酸，0.5mol/L EDTA 4mL，加水稀释至 1000mL］溶液。 2．植物 DNA的检测 1）琼脂糖凝胶制备：称取适量琼脂糖，加入 0.5×TBE溶液，加热配制成 1%的琼脂糖凝胶并加入核酸染料如溴化乙锭（ EB）等，冷却凝固后转移至电泳槽。 2）取适量DNA样品，加入 10×上样缓冲液与 ddH2O配制至总体积 10μL，用移液器转移至凝胶点样孔。 3）电泳后在凝胶成像仪中进行观察，质量好的 DNA应在凝胶中呈现单一亮带（图 1-1A）。 4）取 2μL DNA样品，用紫外分光光度计测定 DNA浓度和质量，纯净的 DNA样品 OD260/OD230≥2且 OD260/OD280≈1.8。OD260/OD280＜1.8说明有蛋白质污染， OD260/OD280＞1.8说明有 RNA污染。 3．植物 DNA的纯化 1）粗提的 DNA在电泳检测时可以看到 DNA条带和降解不完全的 RNA（图 1-1A），加入 RNase，在 37℃下保持 30min即可去除样品中的 RNA（图 1-1B）。 图 1-1葡萄叶片基因组 DNA提取 A．RNase消化之前的 DNA样品；B．RNase消化之后的 DNA样品 2）给去除RNA的 DNA样品中加入 10%体积的 3mol/L乙酸钠，轻轻摇刀 10s左右。 3）给上述DNA样品加入 2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻摇刀后，静置或者放在－20℃冰箱里 1h或者过夜，将漂浮在冷乙醇里的似棉絮状的小团挑出，用预冷的无水乙醇反复洗涤 3次后，挑出棉絮状的小团，置于另一洁净的离心管里，侧壁使预冷的无水乙醇流出，用洁净的吸水纸吸去预冷的无水乙醇，待 5min左右，加入 200μL的 TE溶液［10mmol/L Tris（pH8.0），250mmol/L EDTA］，形成纯化的模板 DNA备用。 1.1.5 注意事项 1）尽量选用较幼嫩的植物组织，如植物的幼芽与幼叶。一是细胞中的核酸占据主导地位；二是细胞处于发育早期，可减少多糖、酚类、蛋白质等大分子物质的影响。 2）研磨时首先使用液氮速冻提取组织，保持绝对冷冻低温，使组织细胞里的 DNA固定，防止 DNA降解，使组织变硬，便于充分研磨，以保证 DNA的提取质量。 3）核酸染料EB有诱变剂作用，操作时应注意个人防护，及时收集用过的染料，防止污染环境。 4）氯仿∶异戊醇进行抽提时离心时间可长些，取上清时保持静置，不要触及下层；应用氯仿、 β-巯基乙醇等化学试剂时应在通风橱中进行，做好个人防护，防止污染环境。 5）整个流程操作应尽量轻柔，不要剧烈摇晃，防止 DNA断裂。 1.2 核糖核酸（RNA）的分离提取 1.2.1 实验目的 细胞中的总 RNA包括 mRNA、rRNA、tRNA和 sRNA，其中有 80%～85%的 rRNA， 15%～20%的 tRNA和 sRNA，1%～5%的 mRNA。分子生物学中研究基因表达、信号转导、基因调控和转录组分析等都需要从植物中分离出高纯度且未降解的 RNA。本实验的目的是掌握从园艺作物中提取、纯化核糖核酸（ RNA）的方法并测定 RNA量。 1.2.2 实验原理 实验室中常用的 RNA提取方法较多，主要包括苯酚法、强变性剂法、阴离子去污剂法、LiCl-尿素法等。这些方法的共同原理是先提取总核酸，然后再选择性地分离出 RNA。