昆虫研究方法(第二版)

**章 昆虫观察设备与使用方法 【内容提要】本章介绍了昆虫的观察设备——显微镜，重点介绍常用的实体显微镜的原理和使用方法等。 【学习目标】系统了解昆虫的主要观察设备。 【基本要求】了解昆虫的观察设备——显微镜及其类型，掌握实体显微镜的原理和使用方法，并能根据不同的目的，选择不同类型的显微镜。 世界上**台显微镜是由荷兰眼镜商Zacharias Jansen于1590年发明，它的出现极大扩展了人类肉眼的观察范围，使科技一举进入了微观领域。随着科技的不断发展，显微镜的性能也得到极大提升，使人们可以观察到更为微观的世界。观察和研究昆虫等生物的显微结构和超微结构时，显微镜是**且重要的仪器。 **节 显微镜的类型 显微镜种类繁多，一般可分为光学显微镜和非光学显微镜两大类，其中光学显微镜使用*多、应用范围*广泛。显微镜根据不同的分类方式可分为以下几种类型。 一、可见光显微镜 可见光显微镜是指利用光谱的可见光部分（380～760nm波长）成像的显微镜，它根据照明技术、成像技术和镜体结构的不同又可分为以下几种。 （一）普通光学显微镜 普通光学显微镜是显微镜中*基本、*普遍的类型。其他各种类型的特种显微镜都是由它演变而来，或者只要在这种显微镜上附加或更换特殊的附件就可以变为其他类型的显微镜。普通光学显微镜分辨率很高，广泛应用于生物学、医学、药物学、细菌学、组织学及胚胎学的研究。 普通光学显微镜由机械装置和光学系统两部分组成（图1-1A）：机械装置包括镜座、镜臂、载物台、镜筒、镜头转换器和调焦螺旋等；光学系统包括物镜、目镜、聚光器、可变光阑、反光镜和光源等。 普通光学显微镜是将被检物体置于聚光器和物镜之间，平行的光线自反射镜折入聚光器，光线经过聚光器穿过透明的物体进入物镜后，即在目镜的焦点平面上（光阑部位或附近）形成一个初生倒置的实像。从初生实像射过来的光线，经过目镜的接目透镜而达到眼球。这时的光线已变成或接近平行光，再透过眼球的晶状体时，便在视网膜后形成一个正立的实像（图1-1B）。 图1-1 普通光学显微镜的构造（A）与成像原理（B） （A.仿黄诗笺等，2001；B. 仿刘国生，2007） （二）暗视野显微镜 暗视野显微镜是在普通光学显微镜的基础上换装暗视野聚光镜，以丁达尔（Tyndall）效应①原理为基础，使照射样本表面的光线不能直接进入物镜和目镜，而是样本表面散射的光线进入物镜，因此整个视野为黑暗的背景，样本则因斜射照明而被照亮（图1-2A），操作者能够观察到样本明亮的外貌及运动状况，但看不清样本内部的细微结构，其分辨率可达4～200nm，为普通光学显微镜的100倍，所以，这种显微镜又叫超显微镜。暗视野显微镜要求载玻片厚度为0.7～1.7mm。 暗视野显微镜广泛应用于生物学研究，用来观察活的标本及明视野所看不到的微小颗粒，通常不用来观察染色的组织切片。 图1-2 暗视野照明方式（A）和BH300暗视野显微镜（B） （A.仿潘大仁，2007） （三）荧光显微镜 图1-3 Leica DM2000荧光显微镜 有些标本的某些特异性物质受到较短波长的光（如紫外光）激发后，会产生波长较长的荧光，这种通过观察荧光来研究标本的特异性物质成分或结构的显微镜为荧光显微镜（图1-3）。 荧光显微镜的光源为紫外光，是在普通光学显微镜的基础上，加上一些附件（如激发滤片和阻断滤片等）构成。激发滤片一般有紫外、紫色、蓝色和绿色等种类，其作用是只允许一定波长的激发光透过并照射到标本上，而将其他光都吸收掉。阻断滤片加在物镜后面：一是吸收和阻挡激发光进入目镜，以免干扰荧光和损伤眼睛；二是选择并让特异的荧光透过，表现专一的荧光色彩。这两种滤光片须配合使用。 荧光显微镜光源波长较短，分辨率高于普通光学显微镜，在生物学和医学中有着广泛的用途，可用于所有含可发荧光物质的细胞结构、细胞器、元素、特异性蛋白质、核酸等生物大分子的定性、定位研究。例如，免疫荧光技术以荧光素作为标记物，与已知的抗体结合形成复合物，再通过抗原抗体结合来检测细胞或组织切片中抗原的分布。 图1-4 相差光学显微镜成像图解（仿刘国生，2007） 1.目镜；2.环状光阑；3.聚光器；4.载物台；5.透镜；6.相板；7.相板剖面图；8.环状光阑剖面图 （四）相差光学显微镜 相差光学显微镜是由荷兰物理学家Zernike于1935年发明的，他因此获得1953年诺贝尔物理奖。相差光学显微镜与普通光学显微镜基本相同，只是在普通光学显微镜上附加了环状光阑和相板等相差滤光装置。光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位（指在某一时间上光的波动所能达到的位置）的不同。当光通过物体时，波长和振幅发生变化，人的眼睛才能观察到，这就是普通光学显微镜下能够观察到染色标本的原理。而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部位微细结构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变化（相位发生的差异即相位差），而这种微小的变化，人眼是无法鉴别的，所以在普通光学显微镜下难以观察到。相差光学显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相位差变成振幅差（明暗差），同时它还吸收部分直射光，以增大其明暗的反差，使不经过染色难以看见的结构变得清晰可见，成像原理见图1-4。相差光学显微镜需用水作封载剂并加盖玻片。载玻片和盖玻片厚度分别为1.0～1.2mm和0.17～0.18mm，清洁无损。 相差光学显微镜主要用于观察未染色的活细胞，能清楚地分辨细胞的形态、细胞核、核仁及胞质中的颗粒结构，也可用于观察固定材料。 图1-5 ZEISS Scope. A1偏光显微镜 （五）干涉相差显微镜 干涉相差显微镜使通过标本的光线和通过标本之外的光线发生干涉，并把光的相位变化转变为振幅变化，从而可以观察染色、染色很淡或未染色物体的细微结构，并能测定标本中干物质的含量。干涉相差显微镜与相差光学显微镜都是以干涉为基础，使透明标本产生高的反差，然而在干涉像产生的方法上却存在着本质的不同：在相差光学显微镜中干涉像是用衍射的方法所产生的；而在干涉相差显微镜中是用通过物体内和物体外两束光干涉的方法产生的，因此干涉的效果可以受到更严格的控制。 干涉相差显微镜现在还未能得到如相差光学显微镜那样广泛的应用，除了因为昂贵的价格以外，其仪器的安装和调节也比相差光学显微镜更加复杂。 （六）偏光显微镜 生物体中的某些组织成分由于光学性质不同，可不经染色而利用偏光来区别。偏光显微镜（图1-5）是在普通光学显微镜中安装两块能使光线偏振的尼科尔棱镜：一块为起偏镜，装在聚光镜下面；另一块为检偏镜，装在目镜和物镜之间。两块棱镜中一块固定，另一块可以旋转（或者两块均可旋转），并注有刻度。偏光显微镜利用偏镜光来鉴别晶体和生物体内某些有序结构的光学性质，也可用来鉴别某些组织中（如组织纤维、骨骼等）的化学成分。 （七）倒置显微镜 图1-6 Leica DMi8倒置显微镜 倒置显微镜（图1-6）是将物镜与照明系统的位置颠倒，前者置于载物台之下，而后者在载物台之上，光线由上往下照射样本，再经过反光镜进入目镜。目的是增大聚光器与载物台之间的工作距离，以便培养细胞或组织的培养皿与培养瓶等容器可直接放在载物台上进行观察。 倒置显微镜在细胞学、寄生虫学、肿瘤学、免疫学、遗传工程学、工业微生物学、植物学等领域中应用广泛，多用于对活体细胞和组织、流质、沉淀物等进行显微研究。 （八）实体显微镜 实体显微镜是一种利用斜射光照明，观察物体外部形态和立体结构的显微镜。其特点是双目观察，工作距离大、视野宽广、便于在镜下进行显微操作、被检物呈正视立体放大像，是昆虫及其他生物形态学、组织解剖学观察的重要工具，还可用于电子工业和精密机械工业零件装配、检验，以及农业上的种子检查等。详见本章第二节相关介绍。 （九）比较显微镜 比较显微镜（图1-7）不仅有普通光学显微镜的作用，还能用一组目镜同时观察左右两个系统物体的像。并通过对接、切割、重叠、旋转等手段，对两个或两个以上的物体进行宏观或微观上的比较，以检查它们在形式、组织、结构、色彩或材料上存在的微小差异，以达到鉴别、比较的目的。随着科学技术的发展，比较显微镜逐步形成完整的系列。其中有适于司法鉴定、银行、电子商检、质检的普通比较显微镜，适于医药、生物、化工等行业使用的生物比较显微镜，还有适于冶金、机械、材料等行业需要的金相比较显微镜。 比较显微镜一般设有摄像、摄影和计算机接口，通过数码相机和电荷耦合器件（CCD），可将显微镜的比较图像输入监视器，多人观察，共同研讨，还可通过视频、打印机直接输出彩色图像。比较显微镜连接计算机后：比较图像——可运用计算机处理；比较结果——可以输入计算机保存，或用彩色打印机输出。 比较显微镜作为特种光学显微镜，其综合、新颖的性能是其他单一用途光学显微镜无法比拟的，已成为光学显微镜家族的新秀，受到越来越多科研人员和有关专业技术人员的青睐，在各个领域中得到广泛运用。在农林畜牧方面，比较显微镜可系统比较不同染色方法染色相同材料的显微切片，以便找出组织或细胞中的特殊结构或特异变化。 图1-7 比较显微镜（实体显微镜）（仿谷祝平，1985） 光学显微镜除了上述分类方法之外，还有其他的分类方法，如根据显微镜的使用范围和性能的高低，可以分为教学显微镜、研究显微镜和大型万能显微镜，在此从略。 二、不可见光显微镜 不可见光显微镜是一类利用非可见光谱形成像、具有特殊用途的显微镜。 （一）紫外光显微镜 紫外光显微镜是一种使用波长在380nm以下的紫外光形成物体像的显微镜。由于被检物体内各种组成对紫外光的吸收能力不同，因此用紫外光显微镜镜检时，容易鉴别未染色的标本。紫外光的波长约为可见光的一半，分辨率也增加一倍，因此能观察到普通方法看不到的结构，对核酸的研究尤为适用。目前主要用于对紫外光有选择吸收性的物质的显微光度和显微分光光度的研究，进行核酸、蛋白质等物质的分布定位和定量研究成为紫外光显微镜*重要、*广泛的用途。 （二）红外光显微镜 红外光显微镜是一种使用波长在760～1500nm的红外光形成物体像的显微镜。红外光显微镜技术是一种非破坏性技术，仅需少量（皮克以下）样品就可获得司法鉴定结果。它还可以使用可见光观察，使不透明的部分物质变得透明，如可用于研究昆虫中渗入黑色素的甲壳质层。 （三）X射线显微镜 X射线显微镜是一种利用波长极短而具强大穿透力的X射线来形成物体像的显微镜，能对细胞内部结构进行立体观测。它为人们提供了一种更深入观察微观世界的方法。X射线是指波长为0.01～30nm的辐射波，其中，1～30nm的波段称为软X射线。软X射线显微镜的突出优点是可以在生物活细胞被破坏之前得出其表面特征和内部结构的图像，这是电子显微镜无法得到的。 X射线显微镜与电子显微镜功能上互为补充，电子显微镜可达到的*高分辨率为0.2～2nm，现有X射线显微镜的分辨率是几十纳米，受到X射线衍射限度的限制，X射线显微镜的分辨率难以超越电子显微镜。因此，X射线显微镜的主要贡献并不在于分辨率极限的突