现代生物技术综合实训

　　《现代生物技术综合实训》：　　质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是*常用、*基本的实验技术。质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。　　一、实验目的　　了解碱裂解法制备质粒的原理，掌握质粒小抽的传统方法和商业化柱层析方法。　　二、实验原理　　从细菌（如大肠杆菌或枯草杆菌）中提取DNA的方法很多，其分离原理可根据.DNA分子大小的不同、碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。目前常用的有碱变性法、酸酚法、PEG法、煮沸法以及溴化乙锭一氯化铯梯度离心法。这些方法各有利弊，有的操作烦琐，难以控制，有的纯度不够，有的需要昂贵的仪器。而碱变性法被认为是一种既经济，且DNA收得率又高的被普遍采用的提取方法。用这种方法提取的DNA可用于酶切、连接和转化。　　碱变性法提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环结构的两条互补链不能完全分离，当以pH为4.8的NaAC缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒.DNA又恢复到原来的构型，保存于溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠连的网状结构，通过离心与不稳定的大分子RNA、蛋白.SDS复合物等一起沉淀下来而去除，从而达到分离的目的。后面可以采用传统的酚+氯仿抽提，酸性、低离子强度时超螺旋DNA在水相中，开环、线型分子在酚相中进行分离的酸酚法；利用商业化DNA结合柱只吸附DNA进行分离纯化。　　（一）裂解细胞　　裂解细胞是指通过溶菌酶、去污剂等试剂破裂细胞壁与膜的过程。对于不同的菌要选用不同的方法，通常有煮沸法、非离子型去污剂法、碱性SDS法（简称碱法）等。三种方法比较而言，非离子型去污剂法较温和，适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈，只能抽提小于10kb的质粒。常用的离子型去污剂是SDS、非离子型去污剂有Tritonx-100等。　　（二）分离　　将质粒DNA和细菌染色体DNA进行分离。碱裂解法的分离原理如下：大肠杆菌的染色体约有4700kb长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双链DNA片段。在pH高达12的碱性条件下，双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链分离成单链；而呈超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢键被破坏，并只发生部分双链解离成单链的变化。再当pH调回中性时，单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的。　　（三）纯化　　细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外还有各种细胞壁、膜碎片、蛋白质、脂质类物质及RNA。纯化的步骤就是有针对性地将它们去除，RNA可用。RNaseA消化。其他杂质可用传统的采酚一氯仿方法抽提除去，残余的蛋白质可通过酚、酚.氯仿、氯仿一异戊醇，使蛋白质变性而除去，同时，氯仿有强烈的溶脂倾向，对于在除去蛋白质的同时去除脂质类杂质很有好处。氯仿还能将微量的、溶于DNA水溶液的酚抽提掉，而微量的酚对于以后的酶切、转化等过程都会产生不利影响。氯仿／异戊醇的蛋白质变性能力较弱，主要用于含酚试剂处理后的抽提。除了传统方法，现代生物技术发展，各种质粒小抽商业化试剂盒出现，使用DNA.的结合柱结合质粒DNA，同时去除杂质，*终获得纯化高的质粒DNA。　　……