微生物学实验(第二版)

**部分 微生物的形态学研究方法 Ⅰ微生物的形态观察 一、细菌的形态观察 实验一普通光学显微镜的使用及活细菌观察 （一）实验目的 （1）学习普通光学显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。 （2）学习并掌握活细菌形态的观察方法。 （二）实验原理 1.显微镜的构造及原理 普通光学显微镜是以日光或电灯灯光作为光源的一种显微镜，被观察的物体通过物镜和目镜的两次放大可将物体放大1500～2000倍。 1）普通光学显微镜的构造 普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一为机械装置，一为光学系统，这两部分很好地配合，才能发挥显微镜的作用。 普通光学显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗调焦手轮、微调焦手轮等部件（图1-1-1）。 普通光学显微镜的光学系统由反光镜、聚光器、物镜、目镜等组成（图1-1-1），现在比较好的显微镜没有反光镜，镜座下装有电光源，通常为15W的卤钨灯。光学系统使物体放大，形成物体放大像。 2）光学显微镜的成像原理 显微镜的放大是通过透镜来完成的，单透镜成像具有像差，影响像质。由单透镜组合而成的透镜组相当于一个凸透镜，放大作用更好。图1-1-2是显微镜的成像原理模式图。A"B"和眼睛的距离为显微镜的明视距离。它的成像原理是：标本的像经过Lo（物镜）后到A'B'处成为一个放大倒立的实像（中间像），FSL0的后焦点。当光线传到Le（目镜）时，在A"B"处A'B'被放大成一个正立的虚像，然后传递到视网膜上，标本就被放大了，人眼看到的是AB被放大后的虚像，与原样品像的方向是相反的。 图1-1-1 普通光学显微镜的构造 图1-1-2 显微镜的成像原理模式图 3）光学显微镜的性能 显微镜分辨能力的高低决定于光学系统的各种条件。被观察的物体必须放大率高，而且清晰。物体放大后，能否呈现清晰的细微结构，首先取决于物镜的性能，其次取决于目镜和聚光镜的性能。 A.数值孔径 也称为镜口率（或开口率），简写为NA，在物镜和聚光器上都标有它们的数值孔径，数值孔径是物镜和聚光器的主要参数，也是判断它们性能的*重要指标。数值孔径和显微镜的各种性能有密切的关系，它与显微镜的分辨力成正比，与焦深成反比，与镜像亮度的平方根成正比。 数值孔径可用下式表示： 式中，n——物镜与标本之间的介质折射率；a——物镜的镜口角。 所谓镜口角是指从物镜主光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度（图1-1-3）。 镜口角a总是小于180°，所以sina/2的*大值小于1。因为空气的折射率为1，所以干燥物镜的数值孔径总是小于1，一般为0.05～0.95；油浸物镜如用香柏油（折射率为1.515）浸没，则数值孔径*大可接近1.5（图1-1-4）。虽然理论上数值孔径的极限等于所用浸没介质的折射率，但实际上从透镜的制造技术看，是不可能达到这一极限的。通常在实用范围内，髙级油浸物镜的*大数值孔径是1.4。 几种物质的介质折射率如下：空气为1.0，水为1.33，玻璃为1.5，甘油为1.47，香柏油为1.52。 图1-1-3 物镜的镜口角 图1-1-4 介质折射率对光线通路的影响 B.分辨力 分辨力是指分辨物体细微结构的能力。分辨力与能够分辨出的物体两点间的*短距离（D）有关。而D又和1/2波长（A）及物镜的数值孔径有关。因为光波只能对比其波长较长的物体造像，所以若某个物体小于1/2波长，光线可绕过该物体，不能造像。 D可用下式表示： 可见光的波长为，平均波长为0.55pm。若用数值孔径为0.65的物镜，则，这表示被检物体在以上时可被观察到，若小于0.42pm就不能视见。如果使用数值孔径为1.25的物镜，则D=0.22pm。凡被检物体长度大于这个数值，均能视见。由此可见，D值愈小，分辨力愈髙，物像愈清楚。根据上式，可通过以下方法来提高显微镜的分辨力：①减小波长；②增大折射率；③加大镜口角。紫外线作光源的显微镜和电子显微镜就是利用短光波来提高分辨力以检视较小的物体的。物镜分辨力的高低与造像是否清楚有密切的关系，目镜没有这种性能，目镜只放大物镜所造的像。 C.放大率 显微镜放大物体，首先经过物镜**次放大物像，目镜在明视距离造成第二次放大像。放大率就是放大物像和原物体两者大小之比例。因此，显微镜的放大率（V）等于物镜放大率（W）和目镜放大率（v2）的乘积，即 比较精确的计算方法，可从下列公式求得 式中，R——物镜焦距； f2——目镜焦距； A——光学筒长； S——明视距离（=250mm）； f——物镜的放大倍数； S——目镜放大倍数； M——显微镜放大倍数。 设，则。 D.焦深 在显微镜下观察一个标本时，焦点对在某一像面时，物像*清晰，则该像面为目的面。在视野内除目的面外，还能在目的面的上面和下面看见模糊的物像，这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深和数值孔径及放大率成反比，即数值孔径和放大率愈大，焦深愈小。因此调节油镜比调节低倍镜要更加仔细，否则容易使物像滑过而找不到。 2.活细菌的观察 芽孢杆菌在自然界中分布广泛，具有耐高温的特性。利用高温加热的方法，可以将稻草中的枯草芽孢杆菌分离出来。 微生物的细胞在显微镜下是透明的，不易观察。因此在观察时应减弱光照、增加反差，才能获得较好的效果，如果光照很强，细菌和周围的液体的差别就难以辨识。 （三）实验材料 （1）材料：稻草、无菌水。 （2）试剂：香柏油、二甲苯。 （3）器材：三角瓶、显微镜、废液缸、洗瓶、凹载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸。 （四）实验方法 1.制备菌液 （1）称取10g稻草，将其剪碎，加人已装有200mL无菌水的三角瓶中，浸泡2h。 （2）将其煮沸30min后，37°C培养24h。 （3）取lmL液体于9mL无菌水中，制成菌悬液。 2.涂凡士林 取洁净无油的盖玻片一块，在其四周涂少量的凡士林。 3.滴加菌液 加1滴菌液于盖玻片中央，并用记号笔在菌液的边缘做一记号，以便显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。 将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液，并轻轻地盖在盖玻片上，使两者粘在一起，然后翻转凹玻片，使菌液正好悬在凹槽的中央，再用铅笔或火柴棒轻压盖玻片，使玻片四周边缘闭合，以防菌液干燥（图1-1-5）。 若制水封片，在载玻片上滴加1滴菌液，盖上盖玻片后即可置显微镜下观察。 图1-1-5细菌悬滴制片法 5.显微镜观察 （1）低倍镜观察：将制好的涂片置于载物台上，用玻片夹夹住，移动推动器，使观察对象处于通光孔中央。旋转粗调焦手轮，使10X物镜下降，直至接近玻片。双眼通过目镜观察，旋转粗调焦手轮，使10X物镜缓缓上升，标本在视野中初步聚焦。再调节微调焦手轮至物像清晰。通过调节推动器，慢慢移动玻片，找到合适的观察目标。 （2）高倍镜的观察：在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，轻轻转动物镜转换器，将高倍镜转换至对准通光孔。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节，使视野内光线均匀，亮度适宜。调节微调焦手轮，使物像清晰。 （五）实验作业 （1）仔细观察所看到的活细菌的形态，并绘出其形态图。 （2）利用显微镜观察活细菌时，应注意哪些问题？ 实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色 （一）实验目的 学习细菌的简单染色和革兰氏染色法。 （二）实验原理 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因为细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是碱性染料和酸性染料的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性（G+）菌和革兰氏阴性（G-）菌两大类，是细菌学上*常用的鉴别染色法。 该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G_菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的紫色。 （三）实验材料 （1）活材料：培养12～16h的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）、培养24h的大肠杆菌（Escherichia coli）。 （2）染色液和试剂：结晶紫（附录四中3）、卢哥氏碘液（附录四中4）、95%乙醇、番红（附录四中5）、复红（附录四中2）、二甲苯、香柏油。 （3）器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。 （四）实验方法 1.简单染色 （1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加1滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金杆菌浓菌液挑2～3环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2～3环涂在右边制成薄的涂面。也可直接在载玻片上制薄涂面，注意取菌不要太多。 （2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 （3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2～3次固定（以不烫手为宜）。 （4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1～2min。 （5）水洗：用水洗去涂片上的染色液。 （6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。 （7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油1滴，将油镜头浸人油滴中仔细调焦观察细菌的形态。 2.革兰氏染色 革兰氏染色的操作程序为：涂片→干燥→固定→结晶紫染色1min→水洗→碘液媒染1min→水洗→95%乙醇脱色20～25s→立即水洗→番红复染5min→水洗→晾干或吸水纸吸干（图1-1-6）。 （1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加1滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块，将刚制成的苏云金杆菌浓菌液挑2～3环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2～3环涂在右边制成薄的涂面。也可直接在载玻片上加水制薄涂面，但取菌不要太多。 （2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 （3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2～3次固定（以不烫手为宜）。 （4）结晶紫染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面为度）的结晶紫染色液染色1m