生物化学与分子生物学实验教程(第3版)

第1篇 总论 实验须知 生物化学与分子生物学实验课是教学的重要环节。通过实验教学，观察某些生化与分子生物学反应现象，联系并加深对理论内容的理解，验证和巩固理论知识；掌握生化与分子生物学实验的基本操作、实验原理和一般仪器的使用；培养科学实验技能和严谨的科学态度，准确记录，科学分析并作出实事求是的实验报告，逐步提高观察问题、分析问题和解决问题的能力，为今后学习生物医学专业后续课程打好必要的基础。 [实验要求] （1）实验前必须预习，明确实验目的，了解基本原理、主要操作、注意事项及预期结果。 （2）实验中操作应严肃认真，注意观察，如实记录实验过程中出现的现象、数据与结果。 （3）实验后及时整理总结，根据实验结果进行科学分析，按时书写并提交实验报告。 [试剂使用] （1）仔细辨认试剂标签，看清名称及浓度，切勿用错。 （2）使用滴管时，滴管尖端朝下，不可倒置，以免试剂流入橡皮帽。 （3）用吸量管取液体时，应该用吸耳球吸，不能用嘴吸。 （4）取出试剂后，立即盖好瓶塞并将试剂瓶放回原处，瓶塞不要盖错。 （5）吸标准溶液时，应先将标准液倒入干净试管中，再用吸量管吸，以防污染瓶中标准溶液。 [实验报告] 包括实验名称、日期、目的、要求、原理、操作、结果、分析、讨论等。 （1）目的要求、原理及操作，应简单扼要的叙述，但必须写清楚操作的关键环节。 （2）一般实验要有结论，扼要简单的说明本次实验获得的结果。 （3）实验数据结果，应归纳整理成各种图表（如标准曲线图、对照与实验组的比较表等）。 （4）分析讨论是对实验方法、结果、异常现象的探讨和评论及对实验设计的认识、体会、建议，不是对结果的重述。 （5）书写报告时应实事求是，字迹清楚、工整，杜绝抄袭。 [实验室清洁] （1）保持实验室的安静与整洁，不随地吐痰及乱丢纸屑；注意卫生，不在实验室里吃食物。 （2）所有固体废弃物（棉花、纱布、滤纸等），须丢入垃圾筒中，不可弃于桌上及水池里。 （3）浓酸应倒入专用小钵中，用水稀释冲淡后再流水冲洗。 （4）有毒及有害物不能扔在簸箕里，应专门收集并无害化处理。 （5）实验完毕，所有公用物品摆放整齐，各自清理自己的实验桌面，清洗所用器材。 （6）实验室由值日小组（依次以实验桌为单位）轮流负责打扫，关好水电及门窗。 [安全注意事项] （1）易燃易爆试剂应远离火源，低沸点有机溶剂如需加热定要用水浴。 （2）发烟或产生有毒气体的实验应在通风橱内进行。 （3）实验室若起火应根据起火性质分别采用沙子、水、四氯化碳灭火器等扑救。 （4）如遇酸碱灼伤皮肤应先及时用水冲洗，酸灼者再用饱和NaHCO3液中和；碱灼者再用饱和H3BO3液中和；氧化剂伤害者用Na2S2O3处理。 （王卉放 钱晖） 第1章 基本操作技术 第1节 玻璃器皿的清洗 生物化学与分子生物学实验常用各种玻璃器皿，其清洁程度直接影响测量样品的可靠性和反应的准确性。因此玻璃器皿的清洁不仅是实验前后的常规工作，而且是一项重要的基本技术。玻璃器皿的清洗方法很多，需要根据实验的要求以及污物性质，选用不同的方法。洗涤的玻璃器皿要求清洁透明，玻璃表面不含可溶解的物质，水沿器壁自然下流时不挂水珠。 一、新购器皿的清洗 新购器皿表面附着油污和灰尘，特别是附着可游离的金属离子。因此，新购器皿需要用肥堪水刷洗，流水冲净后，浸于0.93moI/L Na2CO3溶液中煮沸。用流水冲净后，再浸泡于0.3~0.6mol/L HCl溶液中过夜。流水洗净酸液，用蒸馏水少量多次荡洗后，干燥备用。 二、用过玻璃器皿的清洗 1.—般非计量玻璃器皿或粗容量器皿（如试管、烧杯、量筒等）先用肥皂水刷洗，再用 自来水冲洗干净，*后用蒸馏水荡洗2~3次后，倒置于清洁处晾干。 2.容量分析器皿（如吸量管、滴定管、容量瓶等）先用自来水冲洗，晾干后浸于铬酸洗液中浸泡数小时，然后用自来水和蒸馏水冲洗干净并干燥备用。 3.比色杯用毕立即用自来水反复冲洗，如有污物黏附于杯壁，宜用盐酸或适当溶剂清洗。然后用自来水、蒸馏水冲洗干净。切忌用刷子、粗糙的布或滤纸等擦拭。洗净后，倒置晾干备用。 三、清洗液的种类及配制 1.肥皂水和洗衣粉溶液这是*常用的洗涤剂，主要是利用其乳化作用除去污垢，一般玻璃器皿均可用其刷洗。 2.铬酸洗液广泛用于玻璃器皿的洗涤，其清洁效力来自于它的强氧化性和强酸性。由重铬酸钾（K2Cr2O7）和浓硫酸配制而成，硫酸越浓，铬酸越多，其清洁效力越强。洗液具有强腐蚀性，使用时必须注意安全。当洗液由棕红色变为绿色时则不宜再用。 主要有下列3种配制方法： （1）常用铬酸洗液的浓度为3%~5%。方法是:重铬酸钾5g置250ml烧杯中，加入热水5ml搅拌。为使其尽量溶解，在烧杯下放一石棉网，向烧杯中缓慢加入工业用浓硫酸100ml，随加随搅拌。硫酸不宜加入过快，注意不要溅出来。此时溶液由红黄色变为黑褐色。冷却后装瓶备用并盖严以防吸水。 （2）取100ml工业用浓硫酸置烧杯中，小心加热，然后慢慢加入5g重铬酸钾粉，边加边搅拌，待全部溶解后冷却，贮于具塞的细口瓶中。 （3）取80g重铬酸钾溶于1000ml水中，慢慢加入工业用硫酸，边加边搅拌，冷却后备用。 3.乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）洗液浓度为5%~10%的EDTA-Na2洗液加热煮沸，可去除玻璃器皿内部钙镁盐类的白色沉淀和不易溶解的重金属盐类。 4.草酸洗液草酸5~10g，溶于100ml水中，加入少量硫酸或浓盐酸，可洗脱高锰酸钾的痕迹。 5.尿素洗液45%的尿素溶液是清洗血污和蛋白质的良好溶剂。 6.盐酸-乙醇洗液3%的盐酸-乙醇洗液可以除去玻璃器皿上附着的染料。 7.乙酸-硝酸混合液用于清洗一般方法难以洗净的有机物，*适于清洗滴定管。 8.50g/L Na3PO4 12H2O水溶液碱性液体可用于洗涤油污，所洗器皿不可用于磷的测定。 第2节 吸量管的种类和使用 吸量管是生化实验*常用的仪器之一，微量移液器则是分子生物学实验必用之器材，测定的准确度与吸量管及微量移液器的正确选择和使用密切相关。 一、吸量管的种类 常用的吸量管可以分为3种： 1.移液管常量取50.0ml、25.0ml、10.0ml、5.0ml、2.0ml、1.0ml的液体。这种吸量管只有1个刻度，放液时，量取的液体自然流出后，管尖需在盛器内壁停留15s。注意管尖残留液体不要吹出。 2.奥氏吸管供准确量取0.5ml、l.0ml、2.0ml、3.0ml液体用。此吸量管只有1个刻度，当放出所量取的液体时，管尖余留的液体必须吹入盛器内。 3.刻度吸管供量取10ml以下任意体积的液体。一般刻度包括尖端部分。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖的溶液。此类吸管为“吹出式”，吸管上端标有“吹”或“快”字。未标“吹”或“快”字的吸管，则不必吹出管尖的残留液体。 二、吸量管的使用 1.选用原则量取整数量体积液体并且取量要求准确时，应选用奥氏吸管；量取大体积液体时，要用移液管；量取任意体积（10ml以下）的液体时，应选用取液量*接近的刻度吸管。如取0.15ml液体，应选用0.2ml的刻度吸管。同一定量实验中，要加同种试剂于不同试管中且取量不同时，应选择与*大取液量接近的1支刻度吸管。如各试管应加液体量为0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml时应选用1支1.0ml的刻度吸管。 2.使用中指和拇指拿住吸管上端，食指置吸管上端旁；用橡皮球吸液体至刻度上，眼睛看着液面上升；吸完后用食指顶住吸管顶端，用滤纸擦干其外壁；吸管保持垂直，尖端与试剂瓶接触，用食指控制液体下降至所需体积的刻度处，液体凹面、刻度和视线应在同一水平面上；吸管移入准备接受溶液的盛器中，其出口尖端接触器壁并成一角度，吸管仍保持垂直；放开食指，使液体自动流出。 三、自动移液器的使用 1.操作将吸嘴牢固地装在吸引杆上，装上后轻轻地旋转一下以保证气密；揿按钮到**停止点（A），把吸嘴头尖浸入取样液内2~5mm，释放按钮，使之慢慢返回到初始位置，停留1s；把吸嘴沿取样容器壁滑动从取样液内取出，用滤纸擦去吸嘴外面的液体，注意不要接触到吸嘴头尖孔；把移液器的吸嘴头尖置于加样容器壁上，用拇指慢慢地将按钮揿到**停止点，停留1s（黏性较高的溶液停留时间长些）；然后揿到第二停止点（B），再让吸嘴沿着容器壁向上滑动，当吸嘴头尖与容器壁或溶液不接触时释放按钮，使其返回到初始位置（0），如图1-1和图1-2。 图1-1 自动移液器的构造 图1-2 自动移液器的使用 2.注意事项 （1）当移液器吸取溶液时（尤其是血清、蛋白质和有机溶液），在吸嘴的内壁将会有一薄膜形成，如果吸嘴仅填充1次会导致比规定值大的误差。因为此薄膜在同一吸嘴连续取溶液时能保持相对的常量，则在以后重复填充该吸嘴时能获得较高的精度。所以取样之前通过该溶液预先润洗吸嘴对获得较好的精度是很重要的。 （2）提高移液精度的要点是吸液和排液的速度尽可能一致，切忌“啪”地一下释放按钮；取样时每次浸入相同的液体深度（不得超过5mm）并保持移液器垂直向下；吸取过冷、较热的样品时，应使吸嘴温度与样品温度接近，以免样品热胀冷缩。 （3）注意不要接触会损害吸嘴的硝酸或硫酸溶液。 （4）移液器不能高压消毒，吸嘴可以。 第3节 溶液的混匀、过滤及离心 一、溶液的混匀 生物化学及分子生物学实验中，为使化学反应充分进行，加入试剂后的充分混匀是保证实验成功的又一关键。一般有以下几种混勾方式： 1.腕混匀 右手持试管上端，利用手腕的旋转，使试管作圆周运动，使液体混勻。 2.指弹混匀 左手持试管上部，试管与地面垂直。右手手指呈切线方向快拨试管下部，使管内液体呈涡状转动。 3.吹吸混匀 用吸管、滴管或移液器将溶液反复吹吸数次，使溶液混匀。 4.搅动混匀 用细玻棒搅动大试管或烧杯内容物（如固体试剂）使之混匀。 5.甩动混匀 试管内液体较少时可采用。 6.磁搅拌混匀 一般用于烧杯内容物的混匀。 7.旋涡器混匀 所有混匀操作都应防止管内液体溅出，以免造成液体流失。严禁用手指堵住试管口混匀液体，防止污染和样品的损失。 二、过滤 过滤用于收集滤液、沉淀或洗涤沉淀。在生化实验中如用于收集滤液，应选用干滤纸，不应将滤纸先弄湿，湿滤纸将影响滤液的稀释比例。滤纸过滤一般采用平折法（即对折后再对折），且使滤纸上缘与漏斗壁完全吻合不留缝隙。向漏斗内加液时，要用玻棒引流而且不应倒人过快，勿使液面超过滤纸上缘。较粗的过滤可用纱布或脱脂棉代替滤纸。要将沉淀与母液分开，过滤和离心都可以。当沉淀黏稠或颗粒小得可以通过滤纸时，应选用离心法。溶液量小又需定量测定时，离心分离更有优越性。 三、离心 离心机是利用离心力，分离液体与固体颗粒或液体与液体的混合物中各组分的机械。离心机主要用于将悬浮液中的固体颗粒与液体分开，或将乳浊液中两种密度不同，又互不相溶的液体分开，它也可用于排除湿固体中的液体。离心机种类很多，按离心力来分可将离心机分为常速离心机（600~1200r/min）、高速离心机（3500~50000r/min）、超高速离心机（>50000r/min）