手性固定相分离技术与应用(精)

第1章 绪论 1.1 手性的奥妙 人们把自然界真实存在的镜面或左右对称的，如同人的左右手，明明是实物与镜像的关系，而又不尽相同的现象，称之为手性。手性是物质的本质属性之一，且表现出高度的专一性。从宏观到微观的物质世界，人们发现了许多手性现象（图1-1）。宏观世界里，从右旋的太阳系、右旋的阿尔贝托飓风，到左右旋都有的紫藤、海洋中左旋的鲽鱼和右旋的鲆鱼及左右螺旋的海螺等，都呈现丰富多彩的手性特征。而在这些手性特征背后，又存在许多诡异、令人无法解释的现象，如大多数藤本植物的缠绕方式是右手螺旋的，左旋的藤本植物却相当少见［1］，甚至只在特定地域生长，若强行将藤本植物固有的螺旋缠绕方向改变，它们也会自行恢复到原有的螺旋方向；又如，几乎所有的螺壳都是右手螺旋的，左旋螺壳堪称稀世珍品；微观世界里，生物分子的*基本结构单元——氨基酸在地球上几乎都是L型，构成核酸的糖类基元均为D-核糖，DNA是右手双螺旋构象，而蛋白质二级结构大部分都是右手螺旋，似乎地球上一切生命的图1-1手性物质的世界 基本构成单元（如核酸、氨基酸、蛋白质）都对某一种手性有所偏爱，预示着在另外一些星球上却偏爱着与地球对映的手性特征；在粒子物理层面上，吴健雄的实验已经证明中微子是“左撇子”，近期研究则表明，某些原子核也具有手性［2］。 在化合物的分子层面上，原子组成相同，两个分子结构从平面上没有什么不同。但在空间立体结构上却互为镜像，无法通过旋转而重合，这便是手性异构体。早在1815年，法国科学家比奥发现这种在空间立体结构上的微小变化，能使圆偏振光的偏振方向发生旋转。法国著名科学家巴斯德，随后发现互为镜像的手性分子能使偏振光发生旋转的方向正好相反。科学家将使偏振光向右旋转的称作“右旋异构体”，反之则是“左旋异构体”。当两者混合时，正好能使偏振现象相互抵消，因此混合物称作外消旋混合物（消旋体）。 在有机分子中，以某个碳原子为手性中心时，会存在两种空间构型。实际上，许多有机物不仅仅有一个碳原子，根据碳原子的数量（n）增加，异构体个数成2n个增加。而且，这些有机物分子中不仅存在以碳为中心的手性，还存在以氮、磷和硫为中心的手性，还有以轴、面为手性的。这些手性形成的异构体，在生理、药理活性上就有可能天差地别。 20世纪60年代初发生在西方的“反应停（沙利度胺）事件”，曾如同一颗原子弹爆炸引起世界性轩然大波和忧虑：如果药品中的有害成分不能被及时检测发现，人类的健康有何保障？是否可以采用有效的检测方法和手段，从而避免当时的药物致畸悲剧再现？ 1.1.1 “反应停事件”背后的罪魁祸首 “反应停事件”也称“沙利度胺事件”，其影响并不亚于我国的“毒奶粉事件”。只不过中国的“毒奶粉”是人为添加的，而西方的“反应停事件”是由于当时的科学技术水平落后而造成的。 1957年10月，一种新型的药物沙利度胺风靡欧洲、非洲、澳大利亚和拉丁美洲。受制于当时的科技水平，药品生产厂家宣称其是“没有任何副作用的抗妊娠反应药物”，因而得到一个非常时髦的名字“反应停”，成为“孕妇的理想选择”。1960年，德国和澳大利亚的医生不约而同地注意到，一种罕见的新生儿畸形比例异常升高。1961年，澳大利亚悉尼市皇冠大街妇产医院医生麦克布里德提出“反应停”是婴儿畸形的元凶！他向权威医学杂志《柳叶刀》写信报告了他们医院的4例海豹胎婴儿，母亲均有服用沙利度胺的历史。与此同时，德国汉堡大学的儿科主任兰兹博士也怀疑沙利度胺和海豹胎流行的关系，并展开了一些科学研究，从而把格兰泰公司告上法庭。1961年11月底，格兰泰公司迅速收回了市场上所有产品，这种药物不再允许销售，但这一事件*终导致全世界诞生约1.2万畸形婴儿，这些畸形婴儿没有臂与腿，或是手和脚连在身体，如同海豹的肢体，俗称“海豹婴儿”。 后来的研究找到罪魁祸首，发现沙利度胺实际上是由两种非常相似的化学物组成，相似的就像左右手一样，难以区别，俗称手性化合物。其右手化合物（R-构型）具有抑制妊娠反应活性，而左手化合物（S-构型）有致畸性（图1-2），罪魁祸首就是它！而在当时，一方面，科学界尚不知道长得非常相似的两个化合物在生物体内有这么大的差异；另一方面，即使知道它们的差异，由于检测手段的落后，也无法分辨哪个是左手化合物，哪个是右手化合物。很明显，研究手性化合物对于科学研究以及人类健康有重要意义。 图1-2 沙利度胺的分子结构 “反应停”使人们认识了手性药物在生物活性上的两面性，利用这一特点也推动了创新药物的发现和对老药的重新认识。1998年，美国FDA批准Celgene公司用沙利度胺治疗麻风结节性红斑，但直到2006年才批准沙利度胺用于治疗多发性骨髓瘤。之后Celgene公司相继开发了来那度胺（Lenalidomide）和帕马度胺（Pomalidomide）两个副作用更小的类似物，其中，来那度胺由于对治疗多发性骨髓瘤具有特殊药效，在2017年登上全球抗癌药物销售榜首（图1-3）。 图1-3 来那度胺和帕马度胺 1.1.2 手性药物检验标准急需完善 进入21世纪，现代科学技术如此发达，历史的悲剧是否还会重演呢？20世纪60年代，我国国内因为特殊原因而没有成为“反应停”药物的销售区域，从而有幸避开了这一药物悲剧的发生。但是，改革开放之后，大量国外进口药物及专利过期的仿制药在国内生产并上市，虽然国家食品药品监督管理总局制定了相关药典，以及开展一致性评价来保证与规范药品安全问题，但由于受我国长期落后的药品监督检验技术水平的影响，对手性药物的检测标准还存在很多安全隐患。 文献报道［1］，在《中国药典》（2010年版）中，不完全统计包括1018种不同结构的药物，其中，具有手性中心的药物为440种，占全部药物的43.22%；对药物有明确手性构型要求的有319种，占全部药物的31.34%，不明确要求特定构型的对映体有121种。在日本药典JP 15（Official from April 1，2006生效）中，不完全统计共有896种化合物，其中对手性构型有特定要求的手性药物为434种，占全部药物种类的48.44%，另外还有10种药物分子中有1个或多个手性中心，但在目前版本中对手性构型无明确要求。在欧洲药典EP 7.0（2010版）中，共有1341种化合物，其中712种为手性化合物，占全部药物的53.09%，全部都有要求特定构型的对映体。当然，在《中国药典》（2015年版）中，这种现象大有改进，但尚有许多不足，希望在未来药典的修改中能进一步完善。 对上述中国、日本、欧洲的药典研究统计表明：欧洲药典对所有手性药物都须明确左、右手化合物的有效性，才能进入药典；日本次之，有10种手性药物无明确手性要求；中国有多达121种手性药物无明确手性要求。 主要原因是《中国药典》中有相当一部分是中药，而目前中药的所谓指纹图谱，主要是采用高效液相色谱中的C18柱测定出来的，没有一项是采用手性柱或手性光谱作为标准测定方法或检测标准，这也是中药不易在国际上接受的重要原因之一。当然，也有一些手性西药在研发阶段就缺乏拆分技术与检测手段，以致进入药典之后对手性杂质的控制标准也就不了了之。而美国FDA对于具有手性结构的药物一定要求说明左、右旋异构体的药效之不同，否则不允许上市。此外，在药物生产层面上的手性分离将大大提高生产成本，这些分离技术大部分掌握在发达国家的手中。因此，国家医药科技部门和各级科研部门都应该重视手性分离和不对称合成技术的研发。 1.1.3 药物手性问题的重要性 作为生命活动重要基础的生物大分子和许多作用于受体的活性物质均具有手性特征，如酶、载体、血浆蛋白和多糖等，糖倾向于D-构型，氨基酸几乎全部以L-构型存在，生命就是按照这种D、L构型构筑形成。手性化合物对映异构体在生物活性、生理活性和药理活性等方面存在较大差异甚至可能完全相反的作用。外消旋体和无旋光性物质的化学反应速度是相同的。可是，当有旋光性的试剂进攻两个对映体时，两者的反应速度会显著不同，可能与一种对映体发生反应，与另一种则完全不起反应。因此，手性异构体的识别和组分含量的确定，特别对一些手性药物分子而言非常重要。药物的手性纯度变为药物药效检验中一个关键的问题，在许多国家都制定有关法规，即如果一种药物存在不同的手性结构，不同手性异构体的含量和相关的生理活性必须确定和进行说明。 预计未来，手性药物占新合成药物的比例将上升到80%以上。目前正在开发的处于Ⅱ/Ⅲ临床的实验药物中，80%是单一光学活性体。也就是说，未来新药中有80%是手性药物，而这些手性药物中可能只有某个左手或右手化合物具有治疗作用，它们的另一半或有其他治疗作用、或没有治疗作用甚至具有副作用，其中另一半具有严重副作用的药物就是安全隐患的来源。随着对手性研究的力度增强，越来越多的手性药物差异被报道出来。左氧氟沙星对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的活性比（R）-（+）-氧氟沙星高8～128倍，比外消旋氧氟沙星高3倍［3］。（11S，12S）-甲氟喹和（11R，12R）-甲氟喹不具有抗疟活性［4，5］。（-）-甲氟喹与大脑中的腺苷受体具有高亲和力，因此对中枢神经系统产生副作用，患者经常遇到睡眠障碍、抑郁、焦虑甚至精神病，（+）-甲氟喹不具有腺苷受体亲和力，在疟疾治疗中是更有效的对映体［6，7］。表1-1列出目前上市的异构体活性差异较大的部分手性药物。表1-1异构体活性差异较大的部分手性药物药物有效异构体不良异构体巴比妥类化合物（S）-异构体，镇静药，对中枢神经系统有抑制作用（R）-异构体，惊厥剂，有中枢神经系统兴奋作用布比卡因（S）-异构体，局部麻醉作用（R）-异构体，对心脏有毒性布洛芬（S）-异构体，消炎镇痛（R）-异构体，消炎效果差，增加代谢负担多巴（S）-异构体，治疗帕金森症（R）-异构体，严重副作用氯胺酮（S）-异构体，麻醉剂（R）-异构体，致幻剂青霉素胺（S）-异构体，治疗关节炎（R）-异构体，突变剂普萘洛尔（S）-异构体，治疗心脏病（R）-异构体，有避孕作用心得安（S）-异构体，治疗心脏病（R）-异构体，致性欲下降西替利嗪（R）-异构体，抗过敏（S）-异构体，药效低、有副作用亚叶酸钙（S）-异构体，治疗胃癌、结直肠癌（R）-异构体，副作用比较大乙胺丁醇（S）-异构体，治疗结核病（R）-异构体致盲茚达利酮（S）-异构体，促进尿酸排泄（R）-异构体，增加血中尿酸目前，对于手性药物的认识及检测技术已经不是太困难的事，特别是色谱拆分技术可以满足各种条件下左、右手化合物的测定要求，这种方法不仅能够进行简便快速地定性定量分析，也能进行规模乃至工业规模的生产。 1.1.4 保健食品中的手性 由于人类受各种亚健康和慢性疾病的侵袭，具有一定的营养、调节人体机能、降低疾病风险作用的特殊食品、营养食品和保健食品得到了消费者广泛的认同和关注。世界各国对保健食品的开发非常重视，新功能、新产品、新造型和新食用方法不断出现，利用新资源（如昆虫、海洋生物、植物等）开发新的保健食品以满足人们的需要。近年来，全球保健食品的销售额将超过5000亿美金。 中国关于保健养生实践和学说研究源远流长，形成有特色的保健食品体系。历经几千年的实践，不断在饮食文化中融入传统的中医药学，由此积累了丰富、系统的保健养生文化。药食同源的藤茶就是其中的一个典型例子。藤茶是葡萄科蛇葡萄属的一种野生木质藤本植物，其主要活性成分为黄酮类化合物。藤茶主要含有二氢杨梅素（Ampelopsin/Dihydromyricetin，DMY），这是藤茶活性成分中较为特殊的一种黄酮类手性化合物，其化学名为（2R，3R）-3，5，7-三羟基-2-（3，4，5-三羟基苯基）苯并二氢吡喃-4-酮，部分产地藤茶中的二氢杨梅素含量可达20%以上，这在植物界极为罕见［8］。此类物质具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、消炎等多种功效。国内外有不少保健品