生物分子展示技术:基础与应用

**章 绪论 　　一、生物分子展示技术概述 　　生物分子展示技术（biomolecular display technologies）是利用基因工程的技术和方法将一定长度的核苷酸片段克隆到特定表达载体中，使表达产物（多肽片段或蛋白质）展示在噬菌体或细胞表面的一项技术，通过筛选能够获得与特定配体结合的多肽或蛋白质分子。生物分子展示技术所涵盖的内容非常广泛，既涉及生命体物质基础——核酸、蛋白质、酶等生物分子的结构、组成及相互作用的基础研究，又包含多肽、抗体、疫苗等生物制剂的开发研究，是一项应用广泛、实用性强的分子技术。 　　生物分子展示技术将基因型和蛋白质表型联系在一起，能够利用特异性配基从蛋白质展示文库中筛选出目标蛋白和相应基因序列，是一种强有力的蛋白质筛选工具。生物分子展示技术分为体内展示技术和体外展示技术两类，既包含细胞表面展示系统，又包含非细胞展示系统，既存在真核细胞展示系统，又具有原核细胞展示系统。其中，体内展示技术包括噬菌体表面展示技术、细菌表面展示技术、哺乳动物细胞表面展示技术和酵母细胞表面展示技术；体外展示技术包括核糖体展示技术、mRNA展示技术及DNA展示技术。体内展示技术依赖于细胞表达系统，受到转化效率的影响，库容量往往不高；宿主细胞的生长可能受到表达分子的毒性影响，表达文库的多样性降低；此外，进行抗体分子结构和功能进化研究时，基因突变和表型筛选之间的转化步骤十分烦琐。这些固有缺陷极大地阻碍了体内展示技术的应用，但同时也促进了体外展示技术的出现。体外展示技术不依赖细胞体系，不受克隆和转化效率的影响，库容量大，更有利于进行分子进化和亲和力成熟研究，弥补了体内展示技术的诸多不足。 　　随着生物分子展示技术的成熟，其在生命科学及医药研究领域的应用越来越广泛。一方面，该技术能够帮助阐明生物大分子的作用规律、解析特有的生命现象；另一方面，该技术也能够为药物研发提供强有力的工具，极大地缩短抗体、多肽等生物药物的研发周期。 　　二、生物分子展示技术的发展 　　1953年，Francis Crick和James D. Watson发现了DNA双螺旋的结构，开启了分子生物学时代。分子生物学使生物大分子的研究进入一个新的阶段，使遗传的研究深入分子层次，“生命之谜”被打开，人们清楚地了解遗传信息的构成和传递的途径。 　　1955年，英国生物化学专家Frederick Sanger将胰岛素的氨基酸序列完整地定序出来并推导出完整的胰岛素结构，完成了世界上**个蛋白质（胰岛素）的一级结构测定，揭示了胰岛素的化学结构，并因此荣获1958年的诺贝尔化学奖。 　　1973年，Herbert Boyer和Stanley Cohen经过一年的合作研究，获得了**个重组DNA分子，宣告重组DNA技术的诞生和基因工程时代的到来。 　　1983年，美国Mullis首先提出设想并于1985年发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。 　　DNA双螺旋结构的阐明、胰岛素一级结构的解析、DNA重组技术和PCR方法的问世，这些具有里程碑意义的重大发现为生物分子展示技术的诞生和发展奠定了基础。 　　1985年，George P. Smith**次在丝状噬菌体pⅢ衣壳蛋白N端成功展示了重组肽，为该领域的研究奠定了基础。 　　1986年，Jean Claude Boulain等成功将外源基因插入细菌外膜蛋白编码基因LamB中，并在细菌表面展示出来，这是首次有文献报道的细菌表面展示技术。 　　1990年，Jamie Scott和George P. Smith将编码短肽的随机基因片段与丝状噬菌体表面蛋白pⅢ基因相融合，通过一系列转染流程后将短肽表达在噬菌体表面，首次建立了噬菌体随机肽库。 　　1993年，Maarten P. Schreuder等成功将α半乳糖苷酶与酵母菌α凝集素（α-agglutinin）的C端融合表达在酵母细胞表面，为酵母细胞表面展示技术奠定基础。 　　1994年，Larry C. Mattheakis等首次应用多聚核糖体展示技术建立了多肽库，并应用该技术完成了亲和筛选。 　　1997年，Andreas Pluckthun等在多聚核糖体展示技术的基础上，建立了核糖体展示技术，将正确折叠的蛋白质及其mRNA同时结合在核糖体上，形成mRNA核糖体蛋白质三聚体，使目的蛋白的基因型和表型联系起来。 　　1997年，K. Dane Wittrup等成功将抗荧光素抗体的单链Fv（scFv）片段和c-Myc表位标签展示在酵母菌表面，并利用构建的酵母展示文库进行了亲和筛选，该研究首次提出酵母表面展示的概念。 　　1997年，Hiroshi Yanagawa和Richard W. Roberts等相继报道利用嘌呤霉素将mRNA和编码蛋白共价结合形成mRNA蛋白质复合物，这是*早有关mRNA展示技术的报道。 　　1998年，Dan S. Tawfik等为了筛选具有特定催化功能的酶蛋白，利用DNA模板与催化底物之间的连接，借助于人工细胞建立了一种以DNA作为筛选对象的文库分析技术，该技术对于DNA展示技术的应用至关重要。 　　1999年，Hiroshi Yanagawa等利用链霉亲和素和生物素之间的特异性亲和关系，建立了以模板DNA作为展示对象的链霉亲和素生物素连接（STABLE）技术。 　　2000年，Kevin FitzGerald将一种具有顺式活性的蛋白P2A作为连接DNA和蛋白质的媒介，实现了新生蛋白质同其编码DNA的结合。 　　2002年，Gregory P. Winter利用噬菌体展示技术研发的**个完全人源单克隆抗体（以下简称单抗）药物——阿达木单抗通过美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration， FDA）的批准用于类风湿性关节炎的治疗。 　　2004年，Odegrip等利用另一种具有顺式活性的蛋白RepA建立了顺式展示技术（cis-display），同样实现了DNA和蛋白质的偶联。 　　2004年，Julian Bertschinger等利用Hae Ⅲ DNA甲基转移酶可与DNA末端5氟脱氧胞苷碱基形成共价结合的原理，实现了DNA和编码多肽之间的共价连接。 　　2007年，Florian Hollfelder等利用SNAP标签（O6烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶，AGT）同AGT底物类似物BG（O6苄基鸟嘌呤）的共价结合实现了DNA模板和编码蛋白的连接。 　　2008年，Roger R. Beerli等利用Sindbis病毒表达系统建立了哺乳动物细胞表面展示抗体库，并利用该展示文库顺利完成多个抗体的筛选，标志着哺乳动物细胞表面展示技术的建立。 　　2018年，George P. Smith和Gregory P. Winter因在噬菌体展示领域的开创性工作获得了诺贝尔化学奖。 　　三、 生物分子展示技术与生物医药 　　2003年人类基因组计划顺利完成，揭开了组成人体2.5万个基因的30亿个碱基对的秘密，这一人类科学史上的伟大工程，被誉为生命科学的登月计划。但是，基因组学的破译并不意味着人类遗传信息的完全解读，也难以解释各种生命现象，庞大的基因信息所编码的蛋白质才是细胞活性及功能的*终执行者。因此，对核酸、蛋白质等生物大分子功能和相互作用的研究成为后基因组时代的研究主流。 　　生物分子展示技术作为一种多肽和蛋白质配体发现的重要工具，将基因型和表型联系在一起，在基因和蛋白质的结构与功能研究方面有着不可替代的作用。此外，随着生物医药的快速发展，分子展示技术的研究和应用越来越广泛，尤其在生物药的研发方面取得重大进展，已经成为药物研发的强有力工具。 　　（一）生物分子相互作用的鉴定 　　生物大分子核酸蛋白质相互作用及蛋白质蛋白质相互作用是生命过程中的必然事件，阐明这类大分子之间的相互作用对于揭示细胞的生命现象具有重要意义。生物分子展示技术是将多肽或蛋白质展示在噬菌体或细胞表面，为研究生物大分子相互作用提供便利。例如，James W. Coulton等利用噬菌体展示技术鉴定细菌膜转运蛋白TonB和BtuF之间的相互作用，确定了两种蛋白质潜在的结合残基；Philip W. Hammond等利用人体肝、肾、骨髓和脑的混合cDNA文库构建了mRNA展示文库，利用mRNA展示技术筛选获得70多种不同的Bcl-xL相互作用蛋白，其中包含已知的Bcl-xL相互作用蛋白Bim、Bax和Bak等。此外，Hiroshi Yanagawa等还利用分子展示技术对核酸与蛋白质之间的相互作用进行了研究。利用小鼠脑cDNA文库构建mRNA展示文库，将TPA（12O十四烷酰佛波醋酸酯13， 12-O-teradecanoylphorbol-13-acetate）反应元件作为诱饵DNA，通过mRNA展示技术筛选TPA反应元件相互作用蛋白，结果表明，c-fos和c-jun可以形成异源二聚体并同TPA反应元件以序列特异性的方式相互作用。此外，几乎所有的AP1家族蛋白，包括c-jun、 c-fos、 junD、 junB、 atf2及b-atf等，在经过TPA反应元件固相载体筛选后均得到富集，提示这些蛋白质可能均与TPA反应元件存在相互作用。 　　（二）药物靶点的筛选 　　药物靶点是指药物在体内的作用结合位点，包括受体、酶、离子通道、转运体和核酸等生物大分子。现代新药研究的关键是药物靶点的发现，而活性分子作用靶点的分离和鉴定则是药物研究的重点和难点。随着生物分子展示技术逐步成熟，其在药物靶点筛选方面的应用也逐渐增多。例如，多柔比星作为广谱抑癌化疗药物具有广泛的抗肿瘤活性，但早期因研究手段的限制，其具体作用靶点及机制并不明确，Youngnam Jin等将多柔比星与人类肝脏cDNA噬菌体文库共孵育，成功筛选得到多柔比星靶点蛋白hNopp140。Michael McPherson等利用人肝、肾和骨髓转录本构建了mRNA展示文库，并与固相化FK506共孵育，成功确证FKBP12为FK506的*主要结合蛋白。以上研究表明，分子展示技术可以用于筛选特定活性分子的结合靶点，对于药物靶点的发现具有重要意义。 　　（三）抗体药物研发 　　抗体药物是医药研究领域的重要组成部分，是生物制药市场占主导地位的产品类别，2020年全球十大畅销药物排行榜中抗体药物超过半数。目前，抗体药物已经成为药物研究领域的重点和热点，而生物分子展示技术作为抗体药物研发的重要工具，其发挥的作用愈发重要。噬菌体展示技术无论是作为抗体发现的源头技术，还是作为抗体工程中抗体特性改造时的筛选工具，均有着传统技术不可替代的优势。目前，已有多种抗体药物利用该技术成功上市，包括阿达木单抗、贝利木单抗、雷珠单抗和艾卡拉肽（ecallantide）等，其中Gregory P. Winter利用噬菌体展示技术将鼠源抗体药物人源化，诞生了阿达木单抗，并因此与George P. Smith一起获得诺贝尔化学奖。除了噬菌体展示技术之外，细菌表面展示技术、核糖体展示技术、mRNA展示技术及DNA展示技术均能够用于抗体药物的研发。这些生物分子展示技术不仅能够进行抗体筛选，还可以进行抗体亲和力优化，缩短抗体药物的研发周期。例如，Hiroshi Yanagawa等通过错配PCR和DNA改组技术对抗荧光素抗体片段scFv片段进行随机突变，然后利用mRNA展示技术对scFv突变体库进行筛选，*终获得6个不同的亲和力成熟突变体序列，其中5个存在共有突变。虽然这些突变体的抗原特异性未发生明显改变，但解离速率却下降为原来的1/10，解离常数提高了30倍。总而言之，利用生物分子展示技术对抗体进行筛选和优化能有效缩短抗体药物研发周期，可能成为未来抗体药物研发的主要手段之一。 　　（四）多肽药物研发