基于国家标准的食品微生物检测技术图鉴

**章 食品微生物检验标准及培养基概述 **节 食品微生物检验标准 食品微生物检验是食品安全领域一项重要的检验内容，是衡量食品卫生质量的重要指标，也是判定被检食品是否可食用的科学依据之一。通过食品微生物检验，可以判断食品加工环境及食品卫生情况，能够对食品被细菌污染的程度做出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据。 食品微生物检验通常所用的常规方法为现行国家标准，或国际标准（如ISO标准、FAO标准、CAC标准等），或食品进口国的标准（如美国FDA标准、日本厚生省标准、欧盟标准等）。我国现行国家标准主要为GB 4789系列标准。自2016年以来，我国对食品安全国家标准的食品微生物检验系列标准做出了一系列的调整和变更，现行的如大肠菌群测定、沙门氏菌检验、金黄色葡萄球菌检验等标准由原来的推荐性国家标准变更为国家强制性标准。除了GB 4789系列，还有一部分产品标准中涉及微生物检验，如GB 8538《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》、GB 14963《食品安全国家标准 蜂蜜》等。还有部分微生物相关检测方法如GB 5009.211《食品安全国家标准 食品中叶酸的测定》、GB 5009.259《食品安全国家标准 食品中生物素的测定》等。 GB 4789.1《食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则》中规定了食品微生物检验的各项基本内容，其中实验室基本要求包括了检验人员、环境与设施、实验设备、检验用品、培养基和试剂、质控菌株，还针对不同类型样品的采集、检验做出了规定，对生物安全与质量控制、记录与报告、检验后样品的处理也进行了规定，供食品微生物检验实验室使用。GB 4789.28《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》对食品微生物检验所用培养基和试剂进行了各个方面的规定，包括各类培养基、试剂的配制及质控，各种菌株的保存及使用，质量要求等内容。 除此之外，GB 4789规定了指示菌如菌落总数（GB 4789.2《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》）、大肠菌群计数（GB 4789.3《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》）、霉菌和酵母菌计数（GB 4789.15《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》）等检验方法，以及致病菌如沙门氏菌（GB 4789.4《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》）、金黄色葡萄球菌（GB 4789.10《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》）等检验方法，还有双歧杆菌（GB 4789.34《食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌检验》）、乳酸菌（GB 4789.35《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》）等益生菌的检验方法。本书作为GB 4789系列标准中不同微生物检验方法的配套材料，提供了丰富的微生物培养照片，以供读者参考。 第二节 培养基的成分 培养基（culture medium）是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需要的各种营养物质，由人工配制而成的营养基质，它专供微生物培养、分离、鉴别、研究和保存使用。为了满足微生物生长和代谢的需要，培养基必须包含碳源、氮源、水、无机盐和生长因子五大类营养物质。培养基的研制是微生物学领域的一项重要内容。培养基属于基础应用学科，它广泛地应用于食品、化妆品、医药卫生、工农业、检验检疫、环保等诸多领域。 一般基础培养基中含有蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸膏、氯化钠、琼脂等基本营养成分。一些选择、鉴别培养基根据用途不同，需加入抑菌剂、指示剂、血液、糖等试剂，以利于特定细菌的分离和鉴别。需要使细菌大量生长、繁殖的培养基，主要成分多为氨基酸、核苷酸、无机盐、生长因子等。 琼脂是从石花菜、江篱、紫菜等红藻中提取的一种藻胶，它是由琼脂糖和琼胶质组成的长链多糖化合物。其优点在于不能被细菌分解利用，在细菌培养的温度下凝胶强度稳定。琼脂在细菌培养基中的应用使得细菌培养分离、纯化成为可能，极大地推动了细菌学的发展。 蛋白胨为动物蛋白质经酶消化后得到的产物。蛋白胨在培养基中的主要作用是作为细菌生长代谢过程中所需要的氮源。它的营养价值在于其中含有细菌菌体细胞生长所需要的氨基酸、多肽等成分。 胰酪蛋白胨（casein tryptone）是一种优质蛋白胨，亦称为胰酶消化酪蛋白胨，或称为胰蛋白胨。该蛋白胨系酪蛋白经胰酶消化后，浓缩干燥而成的浅黄色粉末，具有色浅、易溶、透明、无沉淀等良好的物理性状。可配制各种微生物培养基，用于细菌的培养、分离、增殖、鉴定，以及无菌试验培养基、厌氧菌培养基等细菌生化特性试验用培养基的配置。该蛋白胨营养丰富，为生物基因工程高密度发酵技术的实现提供了可能。 大豆蛋白胨是大豆蛋白经木瓜蛋白酶水解而得到的产物，营养丰富，富含碳水化合物和维生素。常用于培养对营养苛求的细菌。大豆蛋白胨不适合用于配制糖发酵试验培养基，因为其中含有大量的碳水化合物。 蛋白胨是一种营养价值较高的蛋白胨，含有高比例的低分子量多肽、氨基酸及促生长元素等。它可用于生产细菌毒素及培养如奈瑟菌、葡萄球菌、嗜血杆菌、布鲁氏菌和棒状杆菌等对营养苛求细菌的培养基中。 牛肉浸膏是采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。易溶于水，水溶液呈淡黄色。牛肉浸膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类等水溶性物质。牛肉浸粉是用瘦牛肉加热抽提的浸出物，经喷雾干燥而形成的粉状物。它富含水溶性动物组织的营养物，如糖类、有机含氮物、水溶性维生素及无机盐等。它们的主要作用是补充蛋白胨及其他氮源的营养不足。一般的用量为0.3%～0.5%。 酵母粉是酵母细胞的自溶物经浓缩、喷雾干燥而成的粉状物。酵母粉富含B族维生素、有机氮及碳水化合物等。酵母粉在培养基中的含量一般为0.3%～0.5%。 胆盐是一种胆酸的钠盐，它是从动物的胆汁中提取的一种混合物，含有胆酸、结合胆酸及胆汁醇等，具体成分及其比例随动物的种属及贮存条件不同而变化。胆盐用在培养基中作为选择性抑制剂，主要抑制革兰氏阳性菌的生长。 第三节 培养基的分类 19世纪末，德国著名细菌学家科赫（R. Koch）成功制备了固体培养基，并发明了玻璃培养皿，引起细菌学的重大变革，同时也极大地推动了细菌的分离和鉴别。从此培养基生产成为一项重要的产业，出现了世界闻名的英国Oxoid公司、美国BD公司和Neogen公司等专业化培养基生产厂家，培育了Oxoid、Difco、Acumedia、Merck、BBL、BioMerieux等许多微生物试剂世界品牌。我国从20世纪50年代开始研制干燥培养基，到目前已有200多种干燥培养基，涌现出了以北京陆桥技术股份有限公司为代表的近百家培养基生产厂家。 培养基按营养物质的来源可分为以下几种。 （1）天然培养基：由化学成分不完全明了的天然物质组成。 （2）合成培养基：全部由已知化学成分的物质组成。 （3）半合成培养基：由不明化学成分的天然物质和已知化学成分的物质组成。 培养基按物理性状可分为以下几种。 （1）液体培养基：不含凝固剂，利于菌体的快速繁殖、代谢和积累产物。 （2）流体培养基：含0.05%～0.07%琼脂，可降低空气中氧进入培养基的速 度，利于一般厌氧菌的生长繁殖。 （3）半固体培养基：含0.2%～0.8%琼脂，多用于细菌的动力学观察、菌种传代保存及贮运细菌标本材料。 （4）固体培养基：含1.5%～2%琼脂，用于细菌的分离、鉴定、菌种保存及细菌疫苗制备等多方面。 培养基按功能可分为以下几种。 （1）运输培养基：在取样后和实验室样品处理前的时间内保护和维持微生物活性的培养基。运输培养基中通常不允许包含使微生物增殖的物质，但是培养基应能保护菌种，确保它们不质变（如Stuart运输培养基或Amies运输培养基）。 （2）保存培养基：用于在一定期限内保护和维持微生物活力，以防对微生物在长期保存中产生不利影响，或使微生物在长期保存后容易复苏的培养基（如Dorset卵黄培养基）。 （3）复苏培养基：能够使受损或应激的微生物修复，使微生物恢复正常生长能力，但不一定促进微生物繁殖的培养基。 （4）增菌培养基：大多为液体培养基，能够给微生物的繁殖提供较适当的生长环境。①选择性增菌培养基：能够保证特定的微生物在其中繁殖，而部分或全部抑制其他菌体生长的培养基（如Rappaport-Vassiliadis培养基）；②非选择性增菌培养基：能够保证大多数微生物生长（如营养肉汤）的培养基。 （5）分离培养基。①选择性分离培养基：支持特定微生物的生长而抑制其他微生物生长的培养基[如DHL琼脂、EMB琼脂、麦康凯（MacConkey或MacC）琼脂]，常用的抑菌剂有胆盐、煌绿、玫瑰红钠、亚硒酸钠，常用的指示剂有溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝等，亚甲蓝是氧化还原指示剂；②非选择性分离培养基：对微生物没有选择性抑制的分离培养基（如营养琼脂）。 （6）鉴别培养基：能够进行一项或多项微生物生理学和生化特性鉴定试验的培养基（如尿素培养基、Kligler琼脂）。能够用于分离培养的鉴别培养基被称为分离/鉴别培养基（如XLD琼脂）。 （7）鉴定培养基：能够产生一个特定的鉴定反应而不需要做进一步确认试验的培养基。用于分离的鉴定培养基被称为分离/鉴定培养基。 （8）多种用途的培养基：同时具有多种不同用途的特定培养基。例如，血琼脂是一种复苏培养基，同时又是分离培养基，用于溶血检测时为鉴别培养基。 第二章 食品微生物图谱 **节 菌落总数 菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定浓度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（毫升）检测样品所生长出来的细菌菌落总数。按国家相关标准的检测方法为，在需氧情况下，（36±1）℃培养（48±2）h，能在营养类琼脂、平板计数琼脂上生长的细菌菌落总数。但厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的细菌及非中温细菌，通常条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时也被称为杂菌数、需氧菌数等。菌落总数测定可用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映了食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。 国家标准（GB）和出入境检验检疫行业标准（SN）使用平板计数琼脂进行菌落计数（图2-1）。在进行菌落总数测定时，培养基表面有时会出现一种生长极快的蔓延菌，影响菌落计数。解决方法是在涂布或倾注好的平板上层再覆盖一层培养基。需要注意的是，不同的方法计数范围不尽相同，GB标准计数范围为30～300cfu/g，而SN标准计数范围为25～250cfu/g。 TTC营养琼脂以TTC作为菌落指示剂，TTC即2，3，5-氯化三苯基四氮唑，是一种菌落指示剂，遇酸变红色。细菌分解糖类产酸，pH降低，所以细菌在TTC营养琼脂上显示暗红色菌落，便于计数（图2-2）。若平板上出现蔓延菌菌落无法计数，则报告菌落蔓延（图2-3）。 图2-1 平板计数琼脂 图2-2 细菌在TTC营养琼脂上的菌落特征 图2-3 蔓延菌在平板计数琼脂上的菌落特征