类风湿关节炎从脾论治研究

**章类风湿关节炎发病机制研究 类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性、炎症性、自身免疫性疾病，以侵蚀性、对称性、多关节炎为主要临床表现，基本病理改变为滑膜炎、血管翳的形成，逐渐出现关节软骨和骨破坏，*终可能导致关节畸形、功能丧失及全身系统病变，类风湿关节炎在全球范围内发病率约为1%，我国的患病率为0.32%～0.36%，女性更容易发病，男女发病率比约为1∶3（张乃峥等，1995）。 类风湿关节炎属于中医学“痹证”“尪痹”范畴，由于风、寒、湿、热、痰、瘀等邪气痹阻经络，导致肢体、筋骨、关节、肌肉等发生疼痛、重着、酸楚麻木，或关节屈伸不利、僵硬、肿大、变形等症状，久痹不愈，复感外邪，邪气内舍而成内痹（脏腑痹）之象。类风湿关节炎的发病机制尚不明确，与环境、感染、免疫、炎症等因素密切相关。该团队重点围绕类风湿关节炎非编码RNA、炎症免疫失衡、细胞凋亡逃逸、氧化应激失衡、高凝状态等发病机制进行了深入研究，丰富了类风湿关节炎发病机制的研究进展，为类风湿关节炎的治疗提供了潜在的靶点。 **节非编码RNA失调参与类风湿关节炎发病 类风湿关节炎的发病机制涉及多因素的综合作用，包括宿主因素（遗传易感性、免疫应答异常、代谢因素及性激素异常等）和环境因素（如细菌及病毒感染）。非编码RNA是近年来研究的热点，在机体的生长发育、细胞代谢、分化、增生与凋亡过程中发挥着重要作用，同时在自身免疫性疾病、神经系统疾病、心血管系统疾病等的发生发展过程中扮演重要角色。故从非编码RNA角度探索类风湿关节炎相关的诊断标志物及相关的治疗靶点尤其重要。 一、非编码RNA的认识 随着现代分子生物学研究的深入，基因表达过程所受的关注已不仅仅局限在“DNAmRNA蛋白质”。长久以来被忽略的非编码RNA（non coding RNA，ncRNA）在基因表达过程中所发挥的调控作用逐渐被发现，其广泛参与人体生理、病理过程的调节。类风湿关节炎是一种自身免疫性疾病，影响其发生发展的因素很多，越来越多的研究发现部分非编码RNA在类风湿关节炎发病过程中出现差异表达并产生显著影响。非编码RNA是一类不编码蛋白质的RNA，包括环状RNA（circular RNA，circRNA）、长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）、微小RNA（micro RNA，miRNA）等。编码RNA主要是参与疾病发展过程的蛋白质。 circRNA是*近研究比较热门的一种特殊闭合环状的内源性非编码RNA，经过前mRNA可变剪切加工并由RNA聚合酶Ⅱ转录而形成。circRNA具有很强的胞内稳定性、高度保守性及组织的特异性，故它能够发挥在转录和转录后调控及翻译蛋白的功能，进而参与多种疾病的发生发展过程。根据基因组的来源及构成序列来分，可将circRNA分为常见的3类：①大部分是外显子来源的circRNA（exonic circRNA，ecircRNA），主要存在于细胞质中，也是目前研究*多的circRNA。②小部分是内含子来源的circRNA（intronic circRNA，ciRNA），但是大多数内含子或内含子片段是不稳定的。③还有一部分是外显子内含子共同形成的circRNA（exon intron circRNA，EIciRNA），是指在circRNA结构中环化的外显子中间保留了内含子序列，但是它的发生机制尚不完全清楚。④*后一类是来自基因内和基因间的circRNA。 lncRNA是一种长度＞200nt的调节性非编码RNA，由聚合酶Ⅱ转录生成，由于缺少可读框，它是不具有编码蛋白质功能的RNA转录物。lncRNA*初被认为是不具有生物学功能的转录“噪声”或垃圾序列。但是现在越来越多研究认为它可能对整个基因表达起调控作用，参与了生物体中广泛的生理和病理过程。大部分lncRNA由5′帽子结构和3′多聚腺苷酸（polyA）尾组成，类似于编码蛋白质的mRNA，但它的保守性较差。lncRNA的来源比较丰富，包括蛋白质编码基因的突变、染色体重排和可转座元件插入等，同样地，lncRNA是根据其编码序列来命名的，分为正义lncRNA、反义lncRNA、双向lncRNA、内含子lncRNA和基因间lncRNA。lncRNA的生物学功能主要包括以下几个方面：①调节细胞分化和组织发育；②染色体剂量补偿；③染色质重塑；④基因组印记；⑤可通过竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）途径，发挥“海绵”样吸附作用，靶向调控miRNA，还可与DNA、RNA或蛋白质分子相互作用，从转录水平调控、表观修饰水平调控和转录后水平调控3个水平调节基因表达；⑥作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；⑦通过结合到特定蛋白上，改变该蛋白的胞质定位；⑧作为小分子RNA，如miRNA、Piwi相互作用RNA（Piwiinteracting RNA，piRNA）的前体分子。 miRNA是非编码的RNA分子，对真核细胞的基因表达、细胞发育分化和个体发育等多方面起调控作用。miRNA是一组无编码功能的RNA，约为22个核苷酸长度，它通过逆向互补结合mRNA的3′非转录区调节基因的表达，miRNA在细胞增殖、细胞分化、细胞周期、细胞凋亡、细胞信号转导、器官的形成等过程中扮演着重要的角色。 二、转录组学研究 转录组学是指一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科。转录组学是从RNA水平研究基因表达的情况。转录组即一个活细胞所能转录出来的所有RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。转录组学的发展，从RNA水平研究类风湿关节炎基因表达的情况，差异基因的筛选有助于为类风湿关节炎的发病提供新见解，阐明其发病新途径。 （一）类风湿关节炎circRNA差异表达谱变化 Wen等（2020a）利用全转录高通量测序技术，对类风湿关节炎患者外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中circRNA表达谱进行鉴定。以P＜0.05，差异倍数＞2为标准，确定了165个circRNA（109个上调和56个下调），GO分析被用来分类和描述基因和基因产物的生物学功能。本体论涵盖了生物过程、细胞成分和分子功能三个领域。GO分析表明，基因主要参与多种生物过程，如细胞器组织、蛋白质修饰过程和细胞信号转导；细胞成分，如细胞膜、细胞质和细胞核；分子功能，如催化活性、ATP结合和蛋白激酶活性。KEGG信号通路分析表明，肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNFα）信号通路、TGFβ信号通路和FoxO信号通路的差异*为显著。 挑选6个差异表达*明显的circRNA（hsa_circ_0001200、hsa_circ_0001566、hsa_circ_0003972、hsa_circ_0008360、hsa_circ_0000734、hsa_circ_0001402），其中3个表达上调，3个表达下调（表11）。对6个差异表达的circRNA进行实时荧光定量聚合酶链反应（real time quantitative polymerase chain reaction，RTqPCR）验证，类风湿关节炎患者PBMC中hsa_circ_0001200、hsa_circ_0001566和hsa_circ_0003972的平均表达水平明显高于健康人，类风湿关节炎患者hsa_circ_0008360明显低于健康人。 为了确定类风湿关节炎患者中显著和差异表达的circRNA是否是类风湿关节炎疾病活动性的相关生物标志物，进行了Spearman相关实验，以评估类风湿关节炎临床特征［红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、超敏C反应蛋白（hypersensitive Creactive protein，hsCRP）、类风湿因子（rheumatoid factor，RF）、抗环瓜氨酸肽抗体（anticyclic citrullinated peptide antibody，antiCCP antibody，简称antiCCP）、免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）、免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、补体C3、补体C4、28个关节疾病活动度评分（disease activity score28，DAS28）、视觉模拟评分法（visual analogue scale，VAS）、焦虑自评量表（selfrating anxiety scale，SAS）、抑郁自评量表（selfrating depression scale，SDS）］和circRNA水平（hsa_circ_0001200、hsa_circ_0001566、hsa_circ_0003972、hsa_circ_0008360）。并发现类风湿关节炎患者的hsa_circ_0001200水平与病程和antiCCP水平呈正相关，hsa_circ_0001566水平与antiCCP呈正相关，与IgA呈负相关；hsa_circ_0003972水平与类风湿关节炎患者的DAS28和关节压痛呈正相关；hsa_circ_0008360水平与病程和antiCCP呈负相关。 （二）类风湿关节炎免疫炎症关键circRNA表达谱变化 Wen等（2021）分析出类风湿关节炎免疫炎症关键circRNA，包括hsa_circ_0003353、hsa_circ_0005732、hsa_circ_0072428、hsa_circ_0091685，其中2个表达上调，2个表达下调（表12）。KEGG分析表明circRNA主要参与Th17细胞分化、血小板活化和白细胞介素17（interleukin17，IL17）信号通路。通过RTqPCR结果表明，与健康对照组相比，类风湿关节炎患者hsa_circ_0003353、hsa_circ_0091685的表达显著升高，hsa_circ_0005732、hsa_circ_0072428的表达明显著下降。受试者操作特征曲线（简称ROC曲线）分析表明hsa_circ_0003353的曲线下面积（area under the curve，AUC）=0.897（P＝0.001）、hsa_circ_0005732的AUC=0.803（P=0.002）、hsa_circ_0072428的AUC=0.721（P=0.014），说明这4个circRNA可协助诊断类风湿关节炎。 Spearman相关性分析结果表明，hsa_circ_0003353与年龄呈正相关，与IgG、RE呈负相关；hsa_circ_0005732与C反应蛋白（Creactive protein，CRP）、IgA、IgM、生理功能（physical functioning， PF）、精神健康（mental health， MH）呈正相关，与补体C4、DAS28呈负相关；hsa_circ_0072428与总体健康（general health， GH）呈正相关，与RF呈正相关。 （三）类风湿关节炎lncRNA差异表达谱变化 Long等(2021)检测了3例类风湿关节炎患者和正常组lncRNA表达谱的变化，与对照组相比，类风湿关节炎患者中有231个lncRNA表达上调，110个lncRNA表达下调。挑选6个差异表达的lncRNA进行临床验证（表13）。 RT-qPCR验证结果表明，与对照组相比，类风湿关节炎组LINC01504、FAM95B1、LINC00304的表达显著升高，MIR503HG的表达显著降低。Spearman相关性分析结果表明