氨基酸生产技术及其应用(“十四五”国家重点出版物出版规划项目 生物工程理论与应用前沿丛书)

第二节 氨基酸生产方法概论 *早的氨基酸产品是谷氨酸， 是以面筋或大豆蛋白为原料利用蛋白质水解提取法制得的。 1956年， 日本协和发酵公司成功地建立了微生物发酵法， 以糖蜜等为原料直接发酵生产谷氨酸， 开创了氨基酸工业生产的新纪元。 在过去的 60多年中， 氨基酸生产技术吸收众多学科成就之长， 出现了一种氨基酸可以用若干种方法生产， 彼此竞争使生产技术不断 提高与完善的兴旺局面， 终于发展成为一门各种氨基酸品种齐全、 生产方法多元化的新产业。 目前， 氨基酸的生产方法有 ４ 种： ①发酵法； ②酶法； ③化学合成法； ④蛋白质水解提取法。 现在， 除个别氨基酸如酪氨酸等采用蛋白质水解提取法生产外， 大多数氨基酸都采用发酵法生产， 但也有几种氨基酸采用酶法 （如天冬氨酸和丙氨酸） 和化学合成法（如甲硫氨酸和甘氨酸） 生产。 一、 发酵法 发酵法是借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力， 通过对微生物菌株进行常规诱变处理， 选育出各种营养缺陷型或／ 和氨基酸结构类似物抗性突变株， 以解除代谢调节中的反馈抑制与阻遏， 达到过量合成某种氨基酸的目的。应用发酵法生产氨基酸产量*大的是谷氨酸， 其次是赖氨酸； 应用该法生产的品种还有苏氨酸、 色氨酸、 缬氨酸、 脯氨酸、 精氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 苯丙氨酸、 谷氨酰胺、 组氨酸、 羟脯氨酸、 鸟氨酸、 瓜氨酸和丙氨酸等。氨基酸高产菌的获得是实现发酵法生产氨基酸的前提， 在氨基酸发酵的建立和改进中起着非常重要的作用。 *初， 将野生型菌株直接用于氨基酸发酵如谷氨酸发酵， 但由于活细胞内反馈调节机制对氨基酸生物合成的严格控制， 一般不可能积累过量氨基酸。 因此，必须获得解除反馈调节、 能过量合成氨基酸的各种遗传变异株。 这主要通过诱变、 筛选各种营养缺陷变异株和改变遗传性状的调节突变株来进行。 体内 （如细胞融合、 转导） 和体外 （如 ＤＮＡ 重组） 遗传操作等*新技术已应用于新型氨基酸生产菌的选育。 诱变法可获得具有营养缺陷型、 氨基酸结构类似物抗性等新遗传特性的菌株， 细胞融合和转导技术则使所需要的遗传特性重组， 而 ＤＮＡ 重组技术可使氨基酸生物合成途径中关键酶基因的拷贝数放大， 从而增加关键酶的酶活力； 基因敲除技术可敲除氨基酸生物合成途径中催化合成副产物的酶的基因， 从而降低副产物浓度， 增加目的产物的产量。根据氨基酸产生菌的遗传性状， 可将其分为 ５ 类： **类为直接使用野生型菌株由糖和铵盐发酵生产氨基酸， 如谷氨酸； 第二类为营养缺陷型变异株； 第三类为氨基酸结构类似物抗性变异株； 第四类为营养缺陷型 （或渗漏型） 兼结构类似物抗性变异株； 第五类为基因改造菌种。 二、 酶法 酶法与发酵法紧密相连， 是发酵工业发展的产物， 但发酵法与酶法之间又有区别。 发酵法是利用微生物的生命活动过程， 将简单的碳源、 氮源， 通过复杂的微生物代谢活动生物合成天然产品， 在品种上有其局限性； 而酶法是利用微生物中特定的酶作为催化剂， 使底物经过酶催化生成所需的产品。 因底物选择的多样性， ?不限于制?天然产物。 借助于酶的生物催化， 可使许多本来难以发酵法或合成法生产的光学活性氨基酸有工业生产的可能。 虽然酶法生产氨基酸具有工艺简单、 专一性强、 浓度高、 周期短、 耗能少、 收率高等优点， 但要将它们应用于工业化生产， 还需要进一步研究。 如何获得廉价的底物和酶源是这一方法能否成功的关键。 近年来， 随着基因重组技术的进步， 有关酶的酶活力显著提高， 加之生物反应器研究成果的配合， 使酶法生产氨基酸技术具有更光明的前景。目前， 能用酶法生产的氨基酸有近 １０ 种， 例如， 以反丁烯二酸 （延胡索酸） 和氨为原料， 经天冬氨酸酶催化生产 Ｌ－天冬氨酸； 以 Ｌ－天冬氨酸为原料， 在天冬氨酸－β－脱羧酶作用下生产 Ｌ－丙氨酸； 在精氨酸脱亚胺酶催化下， 使 Ｌ－精氨酸转变为 Ｌ－瓜氨酸； 以甘氨酸和甲醇为原料， 在丝氨酸转羟甲基酶催化下合成 Ｌ－丝氨酸。 三、 化学合成法 化学合成法是利用有机合成和化学工程相结合的技术生产或制备氨基酸的方法， 其*大优点是在氨基酸品种上不受限制， 除生产天然氨基酸外， 还可用于生产各种特殊结构的非天然氨基酸， 但这并不意味着都具有工业生产价值。 由于合成得到的氨基酸都是 ＤＬ－外消旋体 （甘氨酸除外）， 因此必须经过拆分才能得到人体能够利用的 Ｌ－氨基酸。 故用化学 合成法生产氨基酸时， 除需考虑合成工艺外， 还要考虑异构体的拆分与 Ｄ－异构体的消旋利用， 三者缺一势必会影响其生产成本和应用。氨基酸的化学合成法可归纳为一般合成法和不对称合成法两大类。 前者产物均为 ＤＬ－氨基酸混合物， 后者产物为 Ｌ－氨基酸。 一般合成法包括卤代酸水解法、 氰胺水解法、 乙酰氨基丙二酸二乙酯法、 异氰酸酯 （盐） 合成法及醛缩合法等。 不对称合成法包括直接合成、 α－酮酸反应及不对称催化加氢等方法。 四、 蛋白质水解提取法 以毛发、 血粉以及废蚕丝等蛋白质为原料， 通过酸、 碱或酶水解成多种氨基酸混合物， 再经过分离纯化获得各种氨基酸的方法称为蛋白质水解提取法。 １.酸水解法 蛋白质原料用 ６～１０ｍｏｌ ／ Ｌ ＨＣｌ 或 ８ｍｏｌ ／ Ｌ Ｈ２ ＳＯ４ 于 １１０～１２０℃水解 １２～２４ｈ， 除酸后即得多种氨基酸混合物， 再经过离子交换分离提取得到各种氨基酸。 此法的优点是水解迅速而彻底， 产物全部为 Ｌ 型氨基酸， 无消旋作用； 缺点是色氨酸全部被破坏， 丝氨酸及酪氨酸部分被破坏， 生产环境恶劣， 产生大量废酸液污染环境。 目前采用此法生产的氨基酸只有酪氨酸、 部分亮氨酸等。 ２.碱水解法 蛋白质原料经 ４～６ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＯＨ 于 １００℃ 水解 ６ｈ， 即得多种氨基酸混合物， 再经过离子交换分离提取得到各种氨基酸。 该法水解迅速而彻底， 其优点是色氨酸不被破坏， 但含羟基、 巯基的氨基酸全部被破坏， 且水解过程中产生消旋作用， 故工业上多不应用， 常用于测定蛋白质中色氨酸的含量。 ３.酶水解法 蛋白质原料在一定 ｐＨ 和温度下经蛋白水解酶作用分解成氨基酸和小肽的过程称为酶水解法。 此法优点为反应条件温和， 无需特殊的设备， 氨基酸不被破坏， 无消旋作用； 缺点是水解不彻底， 产物中除氨基酸外， 尚含有较多肽类。 此法主要用于生产水解蛋白及蛋白胨， 而很少用于生产氨基酸。随着氨基酸生产技术的进步， 由蛋白质水解法提取氨基酸这一古老的生产方法受到很大的冲击， 传统的水解法生产谷氨酸早已失去其存在的价值。 半胱氨酸的生产也面临酶法的激烈竞争， 目前， 只有酪氨酸、 少量亮氨酸等采用蛋白质水解法生产。