GLNR和FNR介导植物乳杆菌WU14的NIR表达调控机制

第1章绪论001
1.1亚硝酸盐与食品001
1.1.1亚硝酸盐在食品行业的应用001
1.1.2亚硝酸盐对人体的危害001
1.1.3酱腌菜和泡菜中亚硝酸盐的产生与控制002
1.2亚硝酸盐还原酶002
1.2.1亚硝酸盐还原酶降解亚硝酸盐途径002
1.2.2亚硝酸盐还原酶的分类003
1.2.3亚硝酸盐还原酶的功能003
1.3植物乳杆菌003
1.3.1植物乳杆菌的功能004
1.3.2植物乳杆菌的脱氮能力004
1.3.3植物乳杆菌在酱腌菜和泡菜中的应用004
1.3.4植物乳杆菌WU14005
1.4细菌氮代谢研究005
1.4.1调控因子与启动子的相互作用005
1.4.2GlnR调控因子006
1.4.3Fnr调控因子010
1.4.4Fnr调控因子对细菌氮代谢的调控010
1.4.5luxS和HK等全局性调控因子对亚硝酸盐代谢的调控010
1.5植物乳杆菌遗传转化体系011
1.5.1国内外研究进展011
1.5.2工业应用011
参考文献012 第2章亚硝酸盐胁迫下植物乳杆菌WU14的Nir食品级高效诱导表达及其酶学性质研究020
2.1亚硝酸盐胁迫下植物乳杆菌WU14对亚硝酸盐降解能力分析021
2.2Nir基因克隆和生物信息学分析022
2.3重组质粒pRNA48-Nir的构建及Nir诱导表达026
2.4植物乳杆菌WU14的基因组测序和分析029
2.5结论030
参考文献030
第3章亚硝酸盐胁迫下植物乳杆菌WU14中GlnR与Nir相互作用研究032
3.1Trans 1/pET-30a/Nir表达载体的构建与检测034
3.1.1亚硝酸盐还原酶保守片段Nir的获取034
3.1.2Nir诱导表达载体的构建034
3.1.3Nir蛋白诱导与SDS-PAGE分析034
3.2植物乳杆菌GlnR基因克隆和表达载体的构建与检测036
3.2.1T3-glnR构建036
3.2.2pET-30a-glnR的表达载体构建036
3.3GlnR与Nir启动子体外相互作用研究037
3.3.1pNir启动子基因扩增及Trans1/T3/pNir菌落PCR验证037
3.3.2GlnR基因片段的重新获得037
3.3.3诱饵载体与表达载体的构建038
3.3.4细菌单杂交实验诱饵载体与表达载体酶切验证039
3.4结论043
参考文献044 第4章亚硝酸盐胁迫下植物乳杆菌WU14中GlnR与Nir表达调控机制研究046
4.1利用酵母双杂交研究GlnR与Nir的互作与表达调控046
4.1.1亚硝酸盐还原酶（Nir）基因和GlnR基因的克隆046
4.1.2GlnR-pGBKT7诱饵载体和报告载体Nir-pGADT7的构建046
4.1.3菌落PCR检测重组载体pAD-Nir和pBD-GlnR047
4.1.4融合载体的自激活和毒性检测047
4.1.5亚硝酸盐还原酶（Nir）和调控蛋白GlnR相互作用分析048
4.1.6植物乳杆菌WU14 RNA的提取048
4.2凝胶阻滞验证GlnR蛋白与Nir互作和表达调控049
4.2.1PCR扩增GlnR基因050
4.2.2pPIC9-GlnR表达载体的构建051
4.2.3SDS-PAGE分析重组载体pPIC9-GlnR的表达产物051
4.2.4pE-T30a-GlnR表达载体的构建051
4.2.5GlnR蛋白的诱导表达与纯化052
4.2.6GlnR蛋白与亚硝酸盐还原酶（Nir）的相互作用053
4.3qRT-PCR实验分析亚硝酸盐胁迫GlnR对Nir的表达调控作用053
4.3.1WU14生长曲线测定054
4.3.2实时荧光定量PCR（qRT-PCR）054
4.4结论057
参考文献059 第5章Fnr参与植物乳杆菌WU14亚硝酸盐降解的调控机制061
5.1Fnr和GlnR的重组表达和纯化061
5.1.1fnr和glnR基因扩增及序列分析061
5.1.2Fnr和GlnR克隆载体的构建062
5.1.3Fnr和GlnR重组表达质粒的构建063
5.1.4Fnr和GlnR重组蛋白的诱导表达、纯化和检测064
5.2凝胶阻滞（EMSA）验证Fnr和GlnR与nir启动子的相互作用067
5.2.1PglnR和Pnir启动子序列的扩增生物素标记067
5.2.2EMSA验证Fnr与Pnir启动子的互作068
5.2.3EMSA验证GlnR和Pnir启动子的互作069
5.2.4EMSA验证Fnr和PglnR启动子的互作069
5.3qRT-PCR验证fnr和nir的相对表达量070
5.3.1不同培养条件下植物乳杆菌WU14的生长曲线070
5.3.2植物乳杆菌WU14降解NaNO2能力测试072
5.3.3植物乳杆菌WU14的RNA提取073
5.3.4RNA反转录074
5.3.5fnr和nir相对表达量验证074
5.4结论076
参考文献078 第6章植物乳杆菌WU14 L-阿拉伯糖异构酶分子生物学、发酵工艺优化及热稳定性分子改良079
6.1高产D-塔格糖植物乳杆菌WU14的L-AI基因的分析、食品级诱导表达及其酶学性质的研究080
6.1.1植物乳杆菌WU14生物转化D-塔格糖分析081
6.1.2L-AI基因的扩增与TA克隆081
6.1.3高产D-塔格糖乳酸菌L-AI基因的核苷酸序列分析082
6.1.4高产D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白的二级结构预测分析083
6.1.5高产D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白跨膜螺旋分析和信号肽分析084
6.1.6高产D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白的三级结构预测分析084
6.1.7高产D-塔格糖植物乳杆菌WU14的L-AI酶学性质研究085
6.1.8重组PCR技术去除植物乳杆菌WU14 L-AI基因中的NcoⅠ酶切位点088
6.1.9重组质粒pRNA48-L-AI的构建及验证090
6.1.10SDS-PAGE筛选nisin诱导L-AI基因表达的*佳诱导剂量及诱导时间092
6.1.11L.lactis NZ9000/pRNA48-L-AI重组菌的遗传稳定性分析094
6.1.12L.lactis NZ9000/pRNA48-L-AI重组菌的L-AI酶学性质研究095
6.2植物乳杆菌WU14高产D-塔格糖的发酵工艺优化和分离提纯研究098
6.2.1L-AI发酵动力学模型研究098
6.2.2D-塔格糖分离纯化的研究102
6.2.3硼酸盐催化L-AI产D-塔格糖的研究106
6.3植物乳杆菌WU14的L-AI耐热性分子改良108
6.3.1L-AI同源建模110
6.3.2突变位点的预测111
6.3.3突变体的表达112
6.3.4野生型及突变型L-AI*适温度及热稳定性的测定112
6.3.5野生型及突变型L-AI*适pH及pH稳定性的测定114
6.4结论114
参考文献118 第7章植物乳杆菌WU14 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的基因克隆、蛋白质表达以及生物信息学分析122
7.1植物乳杆菌WU14的8个β-葡萄糖苷酶编码基因的克隆123
7.2SDS-PAGE分析重组蛋白123
7.3目的基因BglAW14、BglBW14、BglCW14、BglDW14、BglEW14、BglFW14、BglGW14和BglHW14的生物信息学分析125
7.3.1氨基酸序列分析、跨膜结构和信号肽预测125
7.3.2氨基酸序列比对分析及系统发育树分析126
7.3.3蛋白质二级结构预测128
7.3.4亚细胞定位128
7.4结论129
参考文献129