包邮高等医药院校基础医学实验教学系列教材--免疫学实验

nbsp;   序
    医学是一门实践性极强的科学，医学实验教学在整个医学教育中占有极为重要的地位，
因此，提高医学实验教学的质量将有助于提高整体医学教育水平。改革传统的以教研室为
单位的教学实验室模式，整合完善现代医学实验室功能和管理是提高医学实验教学质量的
重要环节。传统医学实验教学的主要任务是让学生验证理论知识、增加感性认识，但缺乏对
学生创新能力的培养，因而实验难度不高，实验条件比较简单。随着现代生命科学及其各种
实验技术的飞速发展，必将对现代医学实验教学提出更高的要求，大量先进医学实验进入实
验教学课程体系将成为必然的趋势，要全面推进现代医学实验教学的发展，必须加大对实验
项目、实验条件、实验教学体系改革力度，这对培养适应21世纪医学卫生事业发展的高素质
医学人才有重要意义。近年来，国内很多医科院校对传统医学教学实验建设模式进行较大
力度的改革，积累了不少经验，很多经验值得借鉴。
    围绕跨世纪医学生的培养目标，转变旧的传统观念，打破现行课程框架，重新构建新型
基础医学实验教学体系的改革势在必行。现代高等医药院校实验教学强调培养学生的探索
精神、科学思维、实践能力和创新能力。这就要求从根本上改变实验教学依附于理论教学的
传统观念，充分认识并落实实验教学在学校人才培养和教学工作中的地位，形成理论教学与
实验教学统筹协调的理念和氛围。要从人才培养体系的整体出发，建立以能力培养为主线，
分层次、多模块、相互衔接的科学实验教学体系，使实验教学与理论教学既有机结合又相对
独立。要把学生从二级学科狭隘的“项目”实验教学提高到基于一级学科平台的“方法”实验
教学，*大限度地拓展学生的专业视野。要实现以上目标，除了对实验室进行整合外，其核
心内容就是实验教学教材。为了能够编写出一套适合中西部地区高等医药院校医学教育现
状的实验教学教材，在科学出版社的大力支持下，《高等医药院校基础医学实验教学系列教
材》编委会以重庆医科大学为主体，协同全国26所高等医药院校相关专业的专家教授共同
编写了这套实验教学系列教材。全套共十本，包括《人体大体形态学实验》、《人体显微形态
学实验》、《人体机能学实验》、《病原生物学实验二》、《免疫学实验》、《生物化学与分子生物学实
验》、《医用化学实验》、《医学物理学实验》、《法医学实验》和《核医学实验》。
    本系列实验教材的编写理念是将实验教学按照建设国家实验教学示范中心要求的实验
教学模式，借鉴国外同类实验教材的编写模式，力求做到体系创新、理念创新及编写精美。
内容上将基础医学实验教学按照基础医学实验体系进行重组和有机融合，按照基础医学实
验教学逻辑和规律，将实验内容分为基本实验操作及常用仪器使用、经典验证性实验、综合
性实验和创新性实验等板块进行编写。
    本系列教材编写对象以本科、专科临床医学专业为主，兼顾预防、基础、口腔、麻醉、影
 像、药学、检验、护理、法医、生物医学工程、卫生管理、医学信息等专业需求，涵盖全部医学生
的基础医学实验教学。各层次学生可按照本专业培养特点和要求，通过对不同板块的必选
实验项目和自选实验项目相结合修选实验课程学分。
    由于基础医学实验教学模式尚存在地区和校际间的差异，加上我们的认识深度和编写
水平有限，本系列教材在编写过程中可能存在偏颇之处，请广大医学教育专家谅解，欢迎同
行们提出宝贵意见。
    《高等医药院校基础医学实验教学系列教材》编委会
    2008年3月
 前言
    医学免疫学是生命科学的前沿学科，也是医学生的主干必修课程之一。免疫学理论与
技术的迅猛发展，使其与其他基础学科、临床学科的交叉融合更加深入，免疫学研究成果在
临床的应用越来越广泛。现代免疫学技术已渗透到生命科学的各个领域，有力地推动了基
础医学、临床医学乃至整个生命科学的不断发展。
    随着21世纪高等教育教学改革的深入，实验教学的理念发生了一系列深刻的变化。实
验教学是对学生探索精神、科学思维、实践能力和创新能力培养的重要途径，因此要从根本
上改变实验教学依附于理论教学的传统观念，一改过去旧的实验印证理论模式，充分调动学
生主动学习的积极性，注重能力培养，启迪学生创造性思维。免疫学的实验教学改革和其他
学科一样，仍在思考与探索之中。正是基于实验教学观念的变化，为适应新形势的需要，我
们编写了本教材，希望她能在免疫学的实验教学改革中发挥作用、接受检验。
    本书的编写指导思想是打破传统实验教学模式，不受学生专业与层次的限制，以能力培
养为主线，推进学生自主学习、合作学习、研究性学习。对教学内容进行了大胆的分类、整
合，形成了基础实验操作技术、经典验证性实验、综合性实验、临床免疫实验、创新性实验五
个篇。特别是在创新性实验篇中，体现了我们注重学生能力培养所做的探索。
    基础实验操作技术包含了现代免疫学的基本技术及科研中常用方法技术，特别是为创新性
实验提供了基本技术。经典验证性实验是免疫学*基本的、以验证理论为主的方法技术，能在单
元教学时间内完成，适合各专业本科学生教学，主要培养学生的基本操作技能。综合性实验涉及
多种技术，大多不能在单元教学时间内完成，属选修性质的实验，培养学生的独立工作能力和综
合分析能力。临床免疫实验介绍了部分临床常用免疫学检测技术及其诊断意义，主要培养检验
专业学生的实际操作能力，或为某些专业研究生提供特别的实验技术。创新性实验以培养学生
基本的科学研究能力为主，对象是研究生或本科生科研小组。本篇不设置具体的实验方案与内
容，在讲解一般原则的基础上，提出有一定覆盖面和代表性的设计选题范例或方向，写作手法以
启迪思维为主，但不失指导性与示范性。五篇共27章，包括85个实验，完全能够满足各层次、各
专业免疫学教学的需求。
    本教材由教学经验和实验室经验丰富的教师编写，力求原理讲解清楚，方法介绍明白，不少
内容是作者的经验之谈。适用于五年制、七年制各专业医学免疫学和检验系临床免疫学实验教
学，也可供相关专业教师、研究生，从事临床检验、卫生防疫、免疫学研究的实验技术人员使用。
    本书编写过程中得到了各参编院校领导和同行的大力支持，在此表示诚挚的谢意。
    实验教学改革正在探索之中，本书的编写也是学习、交流、提高认识和不断创新的过程，
不当之处在所难免。真诚希望广大师生和同行们在使用过程中提出宝贵意见和建议，以便
在今后的修订中更臻完善。
    朱道银吴玉章
    2008年2月

 第15章单克隆抗体的制备
  单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)是利用1975年Koehler和Milstein创建的
小鼠B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞杂交瘤技术产生的能特异性结合某种抗原表位的均一
性抗体，也称第二代抗体，这两人因该技术于1984年获诺贝尔医学奖。近年来随着细胞工
程技术的日趋完善，又建立了小鼠一大鼠、小鼠一人、及人一人杂交瘤技术，本章主要介绍小鼠一
小鼠杂交瘤技术。
    利用细胞融合杂交瘤技术制备McAb的基本原理有以下三点。
    1_根据克隆选择学说，一个B淋巴细胞克隆只能够产生识别同一种抗原表位的特异性
抗体，因此只要从多种淋巴细胞克隆中筛选出一种可产生所需要的特异性抗体的淋巴细胞
克隆，即可制备McAb。
    2．细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性，借助物理或化学手
段，将2个或2个1,2t2不同特性的细胞融合在一起，组成一个异型核(heterokaryons)细胞，
这些新形成的异型核细胞即为杂交细胞。如果2个细胞中有一个为瘤细胞，则融合形成的
异型核细胞即称为杂交瘤细胞，此项技术称为杂交瘤技术或抗体的细胞工程技术。
    3．利用了细胞代谢缺陷的补救机制。DNA合成是细胞生存的**条件，细胞可通过
主要合成途径和补救途径合成DNA，前者利用糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶
酸拮抗剂氨基蝶呤可阻断该途径；补救途径是在次黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核糖转化酶(hypo—
xanthine-guanine-phosphoribosyl-transferase，HGPRT)或胸腺嘧啶核苷激酶(thymidine
kinase，TK)作用下，利用次黄嘌呤(hypoxanthine)、胸腺嘧啶核苷(thymidine)等核苷酸前
体合成核苷酸，作为进一步合成DNA的原料。因此将可产生特异性抗体的免疫脾细胞(B
细胞)与不能产生抗体，但可在体内外无限增殖的BALB／c小鼠骨髓瘤细胞融合后，培养于
含次黄嘌呤(hypoxanthine，H)，氨基蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)
的HAT选择培养基中，因其中的A可阻断细胞的叶酸代谢，迫使细胞进入补救途径，依靠
HGPRT或TK，利用培养液中的H和T合成DNA。由于融合用的骨髓瘤细胞缺乏HG—
PRT／TK，不能通过补救途径合成DNA，故未融合或自身融合的骨髓瘤细胞不能合成DNA
而死亡；免疫脾细胞中的B淋巴细胞虽然有HGPRT／TK，但因不能长期生存，一般5～7天
自然死亡；而两种亲代细胞融合形成的杂交瘤细胞，可从免疫脾细胞中获得HGPRT／TK
基因，故能在HAT培养液中生长增殖。因此，上述各种细胞在HAT选择培养液中经2～3
周培养筛选，只剩下永生化的融合杂交瘤细胞。*后经反复克隆和筛选，即可获得只能产生
特异性识别和结合一种抗原表位的杂交瘤细胞克隆(图15—1)。这种杂交瘤既具骨髓瘤细
胞无限增殖的特性，又具免疫B细胞合成和分泌特异性单克隆抗体的能力，可在小鼠体内
外产生大量单一、特异、均一，分子结构、氨基酸序列以及特异性均完全一致的单克隆抗体。
因单克隆抗体纯度高，特异性强，效价高，已被广泛用于生命科学各个领域，并被誉为分子生
物学的解剖刀，诊断医学的万能工具和治疗医学的生物导弹。
    杂交瘤技术是一项周期长、高度连续性的实验技术，涉及大量组织细胞培养、细胞免疫
 学和免疫化学等方法。具体包括动物的选择与免疫；两种亲本细胞的选择、制备与融合；杂
交瘤细胞的选择性培养和克隆化；McAb的制备、鉴定与纯化和杂交瘤细胞的保存与复苏等
步骤，本章将分5个部分作介绍。
实验五-3-四  动物的选择与免疫
    [实验目的]
    掌握免疫方案设计的基本原则；熟悉动物和抗原选择的基本要求；了解小鼠的接种、采
血等方法。
    [实验原理]
    基于抗原刺激机体免疫系统可产生特异性抗体的原理，用特异性抗原免疫动物就可获
得用于制备小鼠杂交瘤细胞的、新近活化的抗原特异性B细胞。选择合适的免疫方案对成
功进行细胞融合杂交，获得高质量的McAb至关重要。免疫方案的制定应根据抗原的性
质、免疫原性和小鼠的免疫反应性等因素来确定。
    [实验材料]
    1．主要试剂
    (1)特异性抗原：根据所需单克隆抗体的特异性，选用含相应抗原表位的特异性抗原作
为免疫原，要求抗原的纯度越高越好。
    (2)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)的配制见第14章，亦可购买商品化
的弗氏佐剂。
    2．动物的选择应选用与骨髓瘤细胞来源相同的动物作为免疫鼠系。制备小鼠杂交
瘤细胞常用的SP2／O、NS-I等骨髓瘤细胞系均来自BALB／c小鼠，故选用6～10周龄，健
康、发育良好的雌性BALB／c小鼠制备免疫B淋巴细胞。
  3．器材配制弗氏佐剂、接种动物、采血、预测效价等所需要的各种器材。
    [实验方法]
    1．颗粒性抗原肿瘤细胞、淋巴细胞、细菌等颗粒性抗原免疫原性强，不加佐剂直接进
行免疫，即可获得较好的免疫效果。一般细胞性抗原的免疫方案是：
    (1)首次免疫是在每只小鼠腹腔或尾静脉注射1×10～5×10个细胞。
    (2)每隔1～2周，采用同样剂量，相同途径重复注射1～2次，末次注射后5～7天采血
检测特异性抗体效价、确定免疫效果。
    (3)融合前2～4天用同样剂量的细胞腹腔或静脉加强免疫一次(融合前加强免疫可增
加脾细胞中近期活化的抗原特异性B细胞的比例，从而提高阳性杂交瘤和特异性MoAb的
产生率)。
    2．可溶性抗原可溶性抗原免疫原性较弱，一般需加佐剂共同免疫。如系半抗原，应
先制备成人工免疫原再加佐剂。可溶性抗原颗粒化或固相化后，可增强抗原的免疫原性、减
少其使用剂量；用细胞因子作为佐剂可以提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原的
免疫反应性。蛋白质、夹膜多糖、病毒、立克次体以及与蛋白质等结合的半抗原均可采用可
溶性抗原的方法免疫。一般免疫方案如下。
    (1)首次取5～100tzg抗原与等量完全弗氏佐剂(CFA)充分乳化后背部皮下或足垫多
点注射，每点0．2ml。
    (2)每隔2周以同样剂量抗原加等量不完全弗氏佐剂(IFA)皮下或足垫多点注射，共
3～5次；末次注射后5～7天采血检测特异性抗体效价，确定免疫效果。
    (3)融合前2～4天用无佐剂的抗原50～100／_tg加强免疫，通常采用腹腔或尾静脉缓慢
注射，以避免动物发生过敏性休克而死亡。   
    (4)脾内直接免疫：小鼠麻醉后，打开腹腔或剪弃小鼠左侧背部体毛，酒精消毒后，用4
号针头直接或隔皮肤，沿脾脏长轴方向缓慢注入20～40可溶性抗原(也可将这些抗原交
联于载体上，以增强其免疫原性)或2．5×10～5×10细胞，免疫后2～4天即可取脾细胞进
行融合。
    (5)体外免疫法：取未免疫小鼠脾细胞，加入含微量抗原、50％条件培养液及50umol／L
2一巯基乙醇(2-ME)的营养液体外培养致敏。一般在20ml脾细胞悬液中加1～100可溶
性抗原或10’个经。。Co照射或固定剂短暂固定的细胞性抗原进行体外免疫。某些对动物有
毒性作用的抗原，均可采用体外免疫方法制备免疫B淋巴细胞。
    (6)体内和体外联合免疫法：先采用脾内法，腹腔或皮下多点注射2～3次进行体内免
疫。融合前的加强免疫改为体外诱导法，常规方法是取免疫小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，用
R／MINI 1640完全培养液悬浮细胞，并加入rHulL-2(终浓度为50U／m1)、rHulL-6(500U／
mi)、PWM(200～500／]g／mi)和特异性免疫原，置5％C02，37。C温箱中培养5天后，收获细
胞供融合用。