精编分子生物学实验指南-(上下册)-(第五版)

目录
译者序
前言
章 大肠杆菌、质粒和噬菌体 1
1.1 培养基的制备及细菌学工具 2
1.1.1 极限培养基 2
1.1.2 丰富培养基 2
1.1.3 固体培养基 3
1.1.4 实验工具 5
1.2 在液体培养基中培养
1.2.1 基本方案1 过夜培养 5
1.2.2 基本方案2 大体积培养 6
1.2.3 基本方案3 利用计数极监测生长情况 6
1.2.4 基本方案4 利用分光光度计监测生长情况 6
1.3 固体培养基上培养 7
1.3.1 基本方案l 通过连续稀释法滴定和分离细菌菌落 7
1.3.2 基本方案2 通过平板划线法分离单菌落 7
1.3.3 基本方案3 通过铺平板分离单个菌落 7
1.3.4 基本方案4 影印平板 7
1.3.5 辅助方案菌株的保存和复苏 8
1.4 经典细菌遗传学选论 8
1.5 质粒载体 13
质粒载体的选择 13
1.6 质粒DNA 的小量制备 20
1.6.1 基本方案1 碱裂解小量制备 20
1.6.2 备选方案 96孔微量滴定板碱裂解法
1.6.3 基本方案2 煮沸小量制备法 22
1.7 质粒DNA 的大量制备 22
1.7.1 基本方案1 碱裂解法制备粗制裂解物 22
1.7.2 基本方案2 氯化铯/溴化乙锭平衡离心法 24
1.7.3 备择方案利用阴离子交换层析或分子筛层析纯化质粒DNA 25
1.8 将质粒DNA 导人细菌细胞
1.8.1 基本方案1 CaC12 转化法
1.8.2 备择方案一步法制备和转化感受态细菌 27
1.8.3 基本方案2 高放率的电转化方法 27
1.9 噬菌体概述 29
1.9.1 裂解性生长 29
1.9.2 溶源性生长 30
1.10 作为克隆载体的噬菌体 32
1.10.1 用噬菌体的优点 32
1.10.2 选择插入的DNA 32
1.10.3 噬菌体来源的克隆载体的图谱 35
1.11 噬菌体铺平板产生噬斑 35
1.11.1 基本方案1 通过连续稀释法分离单个噬斑 35
1.11.2 基本方案2 噬菌体转染和体外包装构建 36
1.12 培养A 衍生的噬菌体载体 37
1.12.1 基本方案通过平板裂解制备噬菌体库 37
1.12.2 备择方案制备液体裂解物 38
1.13 从噬菌体裂解液中制备DNA 38
基本方案 通过分级平衡梯度离心制备DNA 38
1.14 源于丝状噬菌体的载体 40
1.15 利用M13 噬菌体衍生载体制备单链DNA 43
基本方案 利用辅助噬菌体从质粒制备单链DNA 43
第2章 DNA 的制备和分析 45
电泳及其应用 45
凝股和电路 46
2.1 水溶液中DNA 的纯化和浓缩 46
2.1.1 基本方案DNA 的盼抽提和乙薛沉淀 47
2.1.2 备择方案1 异丙醇沉淀DNA 47
2.1.3 辅助方案1 丁醇浓缩DNA 48
2.1.4 辅助方案2 酷抽提法去除残存醋、氯仿或丁醇 48
2.1.5 备择方案2 硅膜离心柱法纯化DNA 49
2.1.6 备择方案3 RNA 及DNA 稀榕液的纯化和浓缩 49
2.1.7 备择方案4 乙酶沉淀法去除低分子质量的寡核背酸和核苷三磷酸 50
2.2 阴离子交换色谱法纯化DNA 50
基本方案 50
2.3 从哺乳动物组织中制备基因组DNA 52
基本方案 52
2.4 从植物组织中制备基因组DNA 53
2.4.1 基本方案氧化铠离心法制备植物DNA 53
2.4.2 备择方案CTAB 制备植物DNA 54
2.5 从细菌中制备基因组DNA
2.5.1 基本方案细菌基因组DNA 的小量制备
2.5.2 备择方案氧化铠法大规模制备细菌基因组DNA 56
2.5.3 辅助方案从脚寻到的DNA 制备物中除去多糖 57
2.6 琼脂糖凝胶电泳 57
2.6.1 基本方案DNA 片段在标准琼脂糖凝股上的分离 57
2.6.2 辅助方案微型凝肢及中型凝肢 58
2.7 脉冲场凝肢电泳 59
2.7.1 基本方案倒转电场凝肢电泳 59
2.7.2 备择方案钳位均匀电场电掠（CHEF电泳） 60
2.7.3 辅助方案高分子质量DNA 样品和分子质量标准物的制备 61
2.8 从琼脂糖凝胶中分离和纯化大的DNA 限制酶切片段 62
2.8.1 基本方案1 琼脂糖凝肢电挽脱 62
2.8.2 基本方案2 NA-45纸电泳 63
2.8.3 基本方案3 低熔点琼脂糖凝肢分离DNA 64
2.8.4 备择方案1 琼脂糖酶消化法从低熔点琼脂糖凝腔中回收DNA 65
2.8.5 备择方案2 硅膜离心桂从低熔点琼脂糖凝腔中回收DNA 65
2.8.6 辅助方案澳化乙键斑点定量法对DNA 浓度进行快速估测 66
2.9 常规凝胶电泳分离小分子DNA 片段 67
2.9.1 基本方案l 非变性聚丙烯酷腔凝肢电旅 67
2.9.2 备择方案聚丙烯酷腊凝肢DNA 小片段的电洗脱 68
2.9.3 基本方案2 筛分型琼脂糖提肢电掠 69
2.10 DNA 的毛细管电泳 69
2.10.1 基本方案1 寡核苷酸的分离 72
2.10.2 基本方案2 定量PCR 分析 73
2.10.3 备择方案基因型分析 75
2.11 Southern 印迹法 75
2.11.1 基本方案用高盐缓冲液在尼龙膜或硝酸纤维素膜上进行Southem 印迹 75
2.11.2 辅助方案紫外透射仪的校准 78
2.11.3 备择方案1 用破性缓冲液在尼龙膜上进行Southem 印迹 78
2.11.4 备择方案2 用向下毛细管转移法进行Southem 印迹 79
2.11.5 备择方案3 从聚丙烯酷脑凝肢至尼龙膜的电转印法 79
2.12 DNA 的斑点和狭线印迹 80
2.12.1 基本方案用多样抽滤加样器在不带电荷的尼龙膜和硝酸纤维素膜上进行DNA斑点和狭线印迹 80
2.12.2 备择方案1 用多样抽撞加样器在带正电荷的尼龙膜上进行DNA 斑点和狭线印迹 82
2.12.3 备择方案2 DNA 斑点印迹的手工制备 82
2.13 DNA 印迹的杂交分析 82
2.13.1 基本方案制才性标记的DNA 探针对DNA 印迹的杂交分析 84
2.13.2 备择方案用放射性标记的RNA 探针对DNA 印迹进行杂交分析 85
2.13.3 辅助方案从杂交膜上除去探针 87
2.14 寡核苷酸的合成及纯化 89
2.14.1 关于核酸的化学合成洁的介绍 89
2.14.2 核酸合成方案 92
2.14.3 寡核苷酸纯化方案 93
2.15 变性聚丙烯酷胶凝胶电泳纯化寡核苷酸 94
基本方案 94
第3章 DNA 和RNA 的酶学操作 97
3.1 限制性内切核酸酶消化DNA 97
3.1.1 基本方案单酶切消化单个DNA 样品 98
3.1.2 备择方案l 多限制性内切核酸酶消化DNA 99
3.1.3 备择方案2 消化多个DNA 样品 101
3.1.4 备择方案3 限制性内切核酸酶对DNA 部分消化 102
3.1.5 辅助方案DNA 的甲基化 102
3.2 核酸操作的常用试剂和放射性同位素 103
3.2.1 储液溶液 103
3.2.2 10X 酶缓冲液 106
3.2.3 核苷兰磷酸 110
3.2.4 标记核酸的放射性同位素 111
3.2.5 基本方案酸沉淀法测定DNA 和RNA 中的放射性 112
3.2.6 备择方案柱离心法从未掺人的前体dNTP 分离放射性标记DNA 113
3.3 DNA 依赖的DNA 聚合酶 114
3.3.1 基本方案1 缺口翻译标记DNA 114
3.3.2 基本方案2 DNA 的31端标记 115
3.3.3 基本方案3 修复凸出的3或5端以产生平端 116
3.3.4 基本方案4 随机寡核苷酸寻|物介导的DNA 标记 116
3.3.5 天然T7 噬菌体DNA 聚合酶 118
3.3.6 经修饰的T7 噬菌体DNA 聚合酶 118
3.3.7 Taq DNA 聚合酶 119
3.4 不依赖于模板的DNA 聚合酶 119
末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶）119
3.5 依赖RNA 的DNA 聚合酶 120
逆转录酶 120
3.6 依艘DNA 的RNA 聚合酶 121
噬菌体的RNA 聚合酶：SP6、T7 和T3 121
3.7 磷酸酶和激酶 122
3.7.1 细菌碱性磷酸酶（BAP） 和小牛肠碱性磷酸酶（CIP） 121
3.7.2 T4 噬菌体多核苷酸激酶 122
3.8 外切核酸酶 122
3.8.1 外切核酸酶VII （ exo VII） 122
3.8.2 噬菌体外切核酸酶（xo） 123
3.8.3 T7 噬菌体基因6 外切核酸酶 123
3.8.4 外切核酸酶III （exo III） 123
3.9 内切核酸酶 124
3.9.1 Bal 31核酸酶 124
3.9.2 Sl核酸酶 124
3.9.3 绿豆核酸酶 125
3.9.4 微球菌核酸酶 125
3.9.5 脱氧核糖核酸酶1 （DNA 酶1） 126
3.9.6 无RNA 酶活性的DNA 酶I 126
3.10 核糖核酸酶 127
3.10.1 核糖核酸酶A （RNA 酶A） 127
3.10.2 元DNA 酶的RNA 酶A 127
3.肌3 核糖核酸酶H （RNA 酶E 127
3.10.4 核糖核酸酶T1 128
3.11 DNA 连接酶 128
3.11.1 T4 幢菌体DNA 连接酶 128
3.11.2 大肠杆菌DNA 连接酶 129
3.12 RNA 连接酶 129
T4 RNA连接酶 129
3.13 DNA 片段的亚克隆 130
3.13.1 基本方案DNA 片段的亚克隆 130
3.13.2 备择方案提肢块中DNA 片段的连接 131
3.14 聚合酶链反应构建重组DNA 132
基本方案DNA 片段亚克隆 132
3.15 非同位素探针的标记和比色检测 132
3.15.1 基本方案1 用切口平移法制备生物素酷化的探针 136
3.15.2 基本方案2 用随机嘉核苦酸引物合成法制备生物素酷化探针 137
3.15.3 辅助方案生物章酷化探针的比包法检测 138
3.15.4 备择方案制备和检测地高辛标记的DNA 探针 139
3.16 非同位素探针的化学发光检测 139
3.16.1 基本方案生物素标记探针的化学发光检测 140
3.16.2 备择方案地高辛标记探针的化学发光捡测 142
3.16.3 辅助方案紫外光源的标准化 142
第4章 RNA 的制备和分析 144
4.1 异硫氨酸脏法制备总RNA 145
4.1.1 基本方案从组织或培养细胞中一步法分离RNA 145
4.1.2 备择方案1 CsCl法纯化从培养细胞中提取的RNA 146
4.1.3 备择方案2 CsCl纯化组织RNA 147
4.2 酣/SDS 法制备植物RNA 148
基本方案 148
4.3 制备细菌RNA 149
4.3.1 基本方案1 从革兰氏阴性菌中分离高质量的RNA 149
4.3.2 备择方案 革兰氏回性菌中快速分离RNA 150
4.3.3 基本方案2 从革兰民阳性菌分离RNA 151
4.4 poly（A）+RNA 的制备 152
基本方案 152
4.5 用单链DNA 探针进行mRNA 的S1 核酸酶作图分析 153
4.5.1 基本方案用M13 模板进行mRNA 的51 作图 154
4.5.2 备择方案l 从现链质粒模板合成单链探针
4.5.3 备择方案2 用寡核脊酸探针进行mRNA 的定量SI 分析 156
4.5.4 辅助方案51 核酸酶mRNA 定量分析的控制（参数） 157
4.6 核酸酶保护试验 157
4.6.1 基本方案 157
4.6.2 辅助方案1 模板DNA 的制备 159
4.6.3 辅助方案2 RNA 探针的胶提纯 159
4.7 引物延伸 160
基本方案 160
4.8 RNA 的Northern 印迹和狭线杂交分析 162
4.8.1 基本方案甲隆琼脂糖凝肢电掠分离RNA 的Northem 杂交 162
4.8.2 备择方案1 经乙工醒/工甲基亚枫处理的变性RNA N orthern 杂交 164
4.8.3 备择方案2 经狭线印迹固定的未分级RNA 样品的Northern 杂交 165
4.8.4 辅助方案Northern 印迹探针的除去 166
4.9 鉴定新转录的RNA 166
4.9.1 基本方案在哺乳动物细胞中的核失控转录 167
4.9.2 备择方案1 用杜恩斯匀浆器分离细胞核 169
4.9.3 备择方案2 藤椅梯度离心分离细胞核 169
4.9.4 辅助方案制备用于核失控转录实验的硝酸纤维素膜 170
第5章 重组DNA 文库的构建 172
5.1 基因组DNA 文库概述 174
5.1.1 代表性与随机性 174
5.1.2 亚基因组文库 174
5.1.3 基因组DNA 文库载体 175
5.2 cDNA 文库概述 175
5.3 噬菌体文库的扩增 176
基本方案 176
5.4 薪粒和质位文库的扩增 177
基本方案 177
第6章 重组DNA 文库的筛选 179
6.1 噬菌体文库的铺平板和转移 181
基本方案噬菌体文库的铺平板和转移 181
6.2 薪粒及质位文库的铺平板和转移 182
基本方案甜粒及质粒文库的铺平板和转移 182
6.3 应用DNA 片段作探针 183
6.3.1 基本方案在甲酷腊榕液中杂交 184
6.3.2 备择方案在水禧液中杂交 184
6.4 使用合成寡核背酸作探针 185
6.4.1 基本方案在氯化铀/拧楝酸铀溶液（C） 中杂交 184
6.4.2 备择方案在氧化四甲镀（TMAC） 中杂交 186
6.4.3 辅助方案棍合寡核脊酸5端标记 188
6.5 噬菌体克隆的纯化 189
基本方案 189
6.6 黏粒和质粒克隆的纯化 190
基本方案 190
6.7 在噬菌体噬斑中产生的融合蛋白的免疫筛选 190
6.7.1 基本方案用抗体筛选gt表达文库 190
6.7.2 备择方案在抗体筛选之前用IPTG 诱导融合蛋白表达 191
6.8 在杂交选择和翻译后进行的免疫筛选 192
基本方案 192
6.9 用单克隆抗体表达克隆 194
6.9.1 基本方案分离编码细胞表面抗原的cDNA 克隆 194
6.9.2 辅助方案1 抗体包被乎板的制备 197
6.9.3 备择方案分离编码细胞内抗原的cDNA 克隆 197
6.9.4 辅助方案2 制备聚偏二乙烯膜包裹的平板 199
6.10 基于重组方法（RBA ） 以筛选k 噬菌体文库 199
基本方案 199
第7章 DNA 序列测定 204
双脱氧（Sanger） 测序法 205
化学（Maxam-G曲创）测序法 207
双脱氧法或化学测序法的选择 208
放射性标记测序反应的替代 208
其他测序技术的进展 209
计辞机分析 210
7.1 DNA 测序策略 210
7.1.1 双脱氧测序 211
7.1.2 化学测序 214
7.2 构建用于DNA 测序的嵌套式缺失体 215
7.2.1 基本方案1 用外切酶III 构建单向缺失突变体 215
7.2.2 备选方案用[a-35 S] dNTP 使DNA 免于外切酶III渭化 218
7.2.3 基本方案2 用Bal31 核酸酶构建嵌套式缺失突变体 219
7.3 制备DNA 测序模板 223
7.3.1 基本方案l 制备单链M13 噬菌体DNA 223
7.3.2 基本方案2 从小量裂解物中制备k 噬菌体DNA 224
7.3.3 基本方案3 小量制备用于化学测序的重组pSP64CS 或pSP65CS 质粒DNA 225
7.3.4 基本方案4 小量制备用于双脱氧测序的双链质粒DNA 226
7.3.5 基本方案5 用于双脱氧测序的双链质粒或k 噬菌体DNA 的碱变性 227
7.3.6 基本方案6 制备用于热循环测序质粒或噬菌体DNA 227
7.4 双脱氧法DNA 测序 228
7.4.1 基本方案l 用测序酶（经修饰的T7 噬菌体DNA 聚合酶）进行标记/终止测序反应 230
7.4.2 备择方案l 使用测序酶和MnH 的标记/终止测序反应 232
7.4.3 备择方案2 使用TaqDNA 聚合酶进行Sanger 测序反应 232
7.4.4 备择方案3 用5'端标记引物进行一步法测序反应 233
7.4.5 基本方案2 用e标i己核苷酸进行热循环测序反应 234
7.4.6 备择方案4 用5'端标记引物进行热循环测序反应 236
7.4.7 备择方案5 使用荧光染料标记的引物和终止物进行循环测序 236
7.5 化学发光双脱氧DNA 测序法 238
7.5.1 基本方案利用生物素标记引物的化学发光DNA 测序法 239
7.5.2 备择方案1 链霉亲和素和生物素酷化碱性磷酸酶两步检测法（间接法） 242
7.5.3 各择方案2 用半抗原标记引物进行测序并用抗体碱性磷酸酶偶联物检测 242
7.6 化学测序法 243
7.6.1 基本方案用P标记的DNA 进行化学测序 244
7.6.2 辅助方案Tth111消化和未端标记 246
7.7 用于测序的变性凝胶电泳 247
7.7.1 基本方案测序脏的灌制、电掠及处理 248
7.7.2 备择方案l 缰冲液梯度测序肢 251
7.7.3 备择方案2 电解质梯度测序肢 251
7.7.4 备择方案3 含甲酷胶的测序股 252
第8章 克隆化DNA 的诱变 253
8.1 用简并寡核苷酸在小段DNA 序列中产生大量突变 254
基本方案 254
8.2 基因合成：用互为引物的长段寡核苷酸组合目的序列 257
基本方案 257
8.3 PCR 介导的随机突变 258
8.3.1 基本方案DNA 序列的突变 259
8.3.2 各择方案一个序列文库的突变 261
8.4 DNA 的接头分区诱变 262
基本方案 262
8.5 PCR 介导的诱变 264
8.5.1 基本方案1 通过PCR 引人限制酶切位点 264
8.5.2 基本方案2 利用PCR 引入点突变 267
8.5.3 备择方案通过连续PCR 引人点突变 270
第9章 DNA 导入哺乳动物细胞 271
转染方法的选择 271
优化转染条件 272
病毒载体 273
哺乳动物细胞培养 274
9.1 磷酸钙转染法 276
9.1.1 基本方案磷酸钙-DNA 在HEPES 中形成祝淀的转染方法 276
9.1.2 辅助方案哺乳动物细胞的甘油/二甲基亚枫休克 277
9.1.3 备择方案在BES 中形成的磷酸钙DNA 沉淀高效转染 277
9.2 DEAE-葡聚糖转染 278
9.2.1 基本方案DEAE葡聚糖转染法的基本操作程序 278
9.2.2 备择方案样本实验2 检测酶的结构/活性关系 280
9.3 电穿孔转染法 281
9.3.1 基本方案电穿孔法转染哺乳动物细胞 281
9.3.2 备择方案植物原生质体细胞的电穿孔转染 281
9.4 阳离子脂质体介导的真核细胞转染 282
9.4.1 基本方案1 阳离子脂质体介导DNA 的哺乳动物贴壁细胞转染 283
9.4.2 备择方案阳离子增强脂质体介导DNA 的哺乳动物贴壁细胞转染 284
9.4.3 基本方案2 阳离子脂质体介导DNA 的悬浮细胞转染 285
9.4.4 基本方案3 阳离子脂质体介导RNA 的贴壁细胞转染 285
9.4.5 基本方案4 阳离子脂质体介导杆状病毒DNA的和昆虫贴壁细胞转染 286
9.4.6 辅助方案阳离子脂质体转染优化条件的微调 286
9.5 转染哺乳动物细胞的选择 288
9.5.1 策略安排 288
9.5.2 基本方案l 哺乳动物细胞的稳定转染 290
9.5.3 基本方案2 哺乳动物细胞的选择标记 291
9.6 遗传报道基因系统概述 295
9.6.1 报道载体的设计 299
9.6.2 体外报道分子分析方法 299
9.7 报道基因活性的同位素分析方法 304
9.7.1 基本方案1 CTA 活性的色谱分析法 304
9.7.2 备择方案1 原位裂解细胞的CAT 分析方法 306
9.7.3 备择方案2 CAT 活性的相抽提分析法 306
9.7.4 基本方案2 人生长激素的放射免疫分析法 307
9.8 非同位素分析报道基因活性 309
9.8.1 基本方案1 萤火虫萤光素酶报道基因分析 309
9.8.2 备择方案冻融裂解的细胞的萤光素酶分析 310
9.8.3 基本方案2 一半乳糖苷酶报道基因的化学发光分析 311
9.9 用维多利亚水母绿色荧光蛋白CGFP） 研究体内蛋白动力学 312
9.9.1 GFP 的应用 312
9.9.2 GFP 的问题 313
9.9.3 GFP 突变体 314
9.9.4 显微镜设置 314
9.10 逆转录病毒转导系统概述
9.10.1 逆转录病毒生活周期
9.10.2 有复制能力的载体 317
9.10.3 元复制能力的载体 318
9.10.4 包装细胞系和病毒的产生 320
9.10.5 鼠逆转录病毒 323
9.以6 禽逆转录病毒 324
9.10.7 安全性问题 324
9.11 建立特异的逆转录病毒产毒细胞系 325
9.11.1 基本方案将逆转录病毒载体导人包装细胞系 325
9.11.2 基本方案2 测定病毒滴度2 高滴度产病毒细胞克隆的鉴定分离 327
9.11.3 备择方案产毒克隆的快速评价 328
9.11.4 辅助方案培养细胞的X-gal 染色 328
9.12 制备高滴度逆转录病毒上清的瞬时转染方法
9.12.1 基本方案1 将逆转录病毒载体瞬时转染人293 细胞系 329
9.12.2 辅助方案293 细胞的生长和保存 330
9.12.3 基本方案2 用逆转录病毒上清感染贴壁细胞 332
9.12.4 备择方案1 旋转感染法感染贴壁细胞 332
9.12.5 基本方案3 用逆转录病毒上清感染非贴壁细胞 333
9.12.6 备择方案2 共培养感染非贴壁细胞 333
9.12.7 备择方案3 旋转感染法感染非贴壁细胞 334
9.13 大规模制备和浓缩逆转录病毒原液
9.13.1 基本方案用离心法制备和浓缩病毒原液
9.13.2 备择方案1 用聚乙二障沉淀及层析法浓缩病毒
9.13.3 备择方案2 用分子质量截留滤膜进行浓缩
9.14 逆转录病毒原液中辅助病毒的检测 337
9.14.1 基本方案通过药物抗性的水平传播鉴定辅助病毒 337
9.14.2 备择方案1 用原病毒检测具复制能力的逆转录病毒 338
9.14.3 备择方案2 用逆转录酶分析法检测辅助病毒 338
9.15 用逆转录病毒在体外及体内感染细胞 339
体外细胞感染 339
0章 蛋白质分析 343
蛋白质分类 343
蛋白质纯化流程图 344
10.1 分光光度分析法和比色法测定蛋白质浓度 350
10.1.1 基本方案1 应用A280来测定蛋白质浓度 350
10.1.2 基本方案2 应用Bradford 法测定蛋白质浓度 350
10.2 定量氨基酸的分析 351
10.2.1 样品准备 351
10.2.2 讨算平均组成 352
10.3 蛋白质的单向SDS 凝胶电泳 353
10.3.1 电与电泳 353
10.3.2 安全性考虑 353
10.3.3 欧姆定律和电泳 354
10.3.4 基本方案1 变性（SDS） 不连续凝肢电泳：Laemmli 凝脏法 355
10.3.5 备择方案1 Tris-tricine 缓冲液系统的PAGE 电泳 358
10.3.6 备择方案2 在无尿素条件下用Tris 缓冲液分离多肤 360
10.3.7 备择方案3 连续SDS 聚丙烯酷胶凝肢电泳 361
10.3.8 备择方案4 超薄凝肢的PAGE 362
10.3.9 辅助方案1 一次灌制多块单一浓度凝胶 363
10.3.10 备择方案5 在梯度凝肢中分离蛋白质 365
10.3.11 辅助方案2 一次灌制多块梯度肢 367
10.3.12 基本方案Z 在单一浓度的微型凝肢上电泳 368
10.3.13 辅助方案3 制各多块梯度肢 370
10.4 使用Farrell 系统的双向凝胶电泳 371
10.4.1 基本方案1 向凝肢（等电聚焦） 371
10.4.2 备择方案1 极端碱性、酸性蛋白质的等电聚焦 373
10.4.3 基本方案2 第二向凝肢 374
10.4.4 备择方案2 小型凝肢双向电泳 376
10.4.5 辅助方案组织来源的蛋白质样品的溶解和制备 377
10.5 凝胶中蛋白质的染色 377
10.5.1 基本方案1 考马斯亮蓝染色 377
10.5.2 备择方案1 考马斯亮蓝快染 378
10.5.3 基本方案2 银染法 378
10.5.4 备择方案2 非氨盐银染法 379
10.5.5 基本方案3 快速银染法 380
10.5.6 辅助方案1 考马斯亮蓝和银染染色的凝胶拍照 381
10.5.7 基本方案3 荧光染色 382
10.5.8 备择方案4 非变性肢的荧光染色 382
10.5.9 辅助方案2 荧光染色肢的拍照 383
10.6 免疫印迹和免疫检测 383
10.6.1 基本方案1 用转移槽转印蛋白质 383
10.6.2 备择方案1 用半干转移系统转印蛋白质 385
10.6.3 备择方案2 染色凝肢的印迹 386
10.6.4 辅助方案1 转印蛋白的可避染色 387
10.6.5 基本方案2 用第三抗体偶联物进行免疫检测 387
10.6.6 备择方案3 用亲和素生物素偶联的第二抗体进行免疫检测 388
10.6.7 基本方案3 用发色底物显迹 389
10.6.8 备择方案4 用发光底物显迹 390
10.6.9 辅助方案2 膜的清洗和再使用 391
10.7 凝胶过滤层析 391
10.7.1 基本方案1 脱盐（组分分离） 391
10.7.2 基本方案2 蛋白质的分级 397
10.7.3 基本方案3 分子大小的测定 400
10.7.4 辅助方案柱校正 401
10.8 离子交换层析 404
10.8.1 设计策略 404
10.8.2 基本方案1 批式吸附和增加盐浓度的阶段梯度就脱 405
10.8.3 基本方案2 线性梯度洗脱的柱层析 407
10.8.4 辅助方案进行小试确定离子交换层析的起始条件 409
10.9 免疫亲和层析 414
10.9.1 基本方案可癖性或膜结合抗原的分离 414
10.9.2 备择方案1 抗原的批式纯化 416
10.9.3 备择方案2 低pH 挽脱抗原 416
10.10 金属整合亲和层析 417
10.10.1 基本方案天然MCAC 对可溶性组氨酸尾融合蛋白的纯化 417
10.10.2 备择方案1 变性条件下用MCAC 纯化带组鲸酸尾的不禧性融合蛋白 420
10.10.3 备择方案2 MCAC 纯化蛋白质的固相复性 421
10.10.4 辅助方案NTA 介质的再生 421
10.11 多肤和蛋白质的HPLC准备工作和系统组装 422
10.11.1 多肤和蛋白质的属性及其在HPLC 方法发展的应用 422
10.11.2 HPLC 中多肤和蛋白质的检测 422
10.11.3 起始程序 423
10.11.4 样品的准备 425
10.11.5 准备流动相 425
10.11.6 组装HPLC 装置 426
10.11.7 用揽脱液活化泵和低压线 426
10.11.8 HPLC 系统的准备 426
10.11.9 HPLC 系统的梯度延梅（滞留体积） 427
10.11.10 和柱连接 428
10.11.11 给HPLC 装置设计程序 428
10.11.12 注射样品 428
10.11.13 检测功能性HPLC 系统428
10.11.14 日志 428
10.12 多肤和蛋白质的HPLC：标准操作条件 429
10.12.1 HP- SEC 的标准操作条件 430
10.12.2 HP-NPC 的标准操作条件 431
10.12.3 HP-HIC 的标准操作条件 432
10.12.4 HP- IEX 的标准操作条件 433
10.12.5 HP-HILIC 的标准操作条件 434
10.12.6 HP-IMAC 的标准操作条件 435
10.12.7 HP-BAC 的标准操作条件 436
10.12.8 RP-HPLC 的标准操作条件 437
10.12.9 用RP-HPLC 技术对多肤和蛋白质温合物脱盐 440
10.13 肤的反相分离 441
10.13.1 基本方案1 5-500PMOL 水平肤的反相分离 441
10.13.2 基本方案2 不超过5 pmol 肤的反相分离 442
10.13.3 辅助方案毛细管HPLC 系统的装配 443
10.14 通过表位标签纯化重组蛋白研究蛋白质互相作用 444
基本方案带表位标签重组蛋白的免疫沉淀 444
10.15 免疫沉淀 446
10.15.1 基本方案1 用非变性去垢剂溶液裂解的悬浮细胞的免疫沉淀 446
10.15.2 备择方案1 用非变性去垢剂榕液裂解的贴壁细胞的免疫沉淀 449
10.15.3 备择方案2 用变性去垢剂裂解的细胞的免疫沉淀 450
10.15.4 备择方案3 不用去垢剂裂解的细胞的免疫沉淀 450
10.15.5 备择方案4 用抗体-Sepharose 偶联物免疫沉淀 451
10.15.6 辅助方案制备抗体-Sepharose 偶联物 453
10.15.7 各择方案5 用抗Ig 血清免疫祝淀放射性标记抗原 454
10.15.8 基本方案2 免疫沉淀一重俘获 455
10.16 克隆化基因的体外转录和翻译 456
基本方案 456
10.17 氨基酸代谢标记 458
10.17.1 标记复合物操作的安全预防 458
10.17.2 基本方案标记甲硫氨酸对悬浮培养细胞的脉冲标记 459
10.17.3 各择方案1 贴壁细胞的[35 S] 甲硫氨酸脉冲标记 460
10.17.4 备择方案2 甲硫氨酸脉冲示踪标记细胞 460
10.17.5 备择方案3 甲硫氨酸的长期细胞标记 461
10.17.6 备择方案4 用其他放射性标记的氨基酸进行代谢标记 461
10.17.7 辅助方案TCA 祝淀测定标记掺入量 462
10.18 分离蛋白质用于微量序列分析 463
10.18.1 基本方案1 测定通过SDS-PAGE 转移到PVDF 膜上样品的氨基酸序列 463
10.18.2 辅助方案准备SD S-PAGE 蛋白质样品 465
10.18.3 基本方案Z 测定N 端封闭蛋白质的内部序列 466
10.19 蛋白质和多肤的毛细管电泳 467
10.19.1 使用仪器 467
10.19.2 战略计划 469
10.19.3 基本方案1 等电点聚焦分离蛋白质 469
10.19.4 基本方案2 蛋白质的分离 470
10.19.5 基本方案3 解析多肤的分离 471
10.19.6 基本方案4 微量制备毛细管电泳多次分离 472
10.19.7 备择方案微量制备毛细管电泳单次分离 473
1章 免疫学 475
11.1 酶与抗体的偶联 477
11.1.1 基本方案辣根过氧化物酶HRPO 与抗体的偶联 477
11.1.2 备择方案碱性磷酸酶与抗体的偶联 478
11.2 酶联免疫吸附分析（ ELISA） 478
11.2.1 基本方案间接ELISA 法检测特异性抗体 479
11.2.2 备择方案1 直接竞争ELISA 法检测可溶性抗原 480
11.2.3 备择方案2 抗体夹心ELASA 法检测可潜性抗原 481
11.2.4 备择方案3 双抗体夹心ELISA 检测特异性抗体 482
11.2.5 备择方案4 直接细胞ELISA 法检测细胞表面抗原 483
11.2.6 备择方案5 间接细胞ELISA 法检测对表面抗原具有特异性的抗体 484
11.2.7 辅助方案1 正交连续稀释法确定*佳试剂浓度 485
11.2.8 辅助方案2 制备细菌裂解物抗原 486
11.3 老鼠的免疫 487
11.3.1 基本方案制备免疫脾细胞：用可溶性抗原致敏 487
11.3.2 备择方案1 用复合抗原（膜、整个细胞和微生物）进行免疫 488
11.3.3 备择方案2 用电泳分离的抗原进行免疫 488
11.4 单克隆抗体上清和腹水的制备 488
11.4.1 基本方案1 单克隆抗体上清的制备 489
11.4.2 备择方案1 单克隆抗体上清的大量制备 489
11.4.3 备择方案2 大量制备杂交瘤或细胞系 490
11.4.4 基本方案2 含单克隆抗体的腹水的制备 491
11.5 单克隆抗体的纯化 492
11.5.1 基本方案用蛋白A-琼脂糖进行纯化 492
11.5.2 备择方案1 蛋白A-琼脂糖的备择缓冲液系统 493
11.5.3 备择方案2 用抗原一葡聚糖和抗鼠Ig-葡聚糖进行纯化 493
11.6 多克隆抗血清的制备 494
11.6.1 基本方案用弗民佐剂免疫制备多克隆抗体 495
11.6.2 备择方案应用其他佐剂制备多克隆抗血清 496
11.6.3 辅助方案由全血制备血清 497
11.7 从抗血清、腹水或杂交瘤上清液中纯化免疫球蛋白G组分 497
11.7.1 基本方案用饱和硫酸镀沉淀IgG 497
11.7.2 备择方案用DEAE-Affi-Gel Blue层析法分级分离IgG 498
11.8 免疫原性肤的选择 499
11.9 抗肤抗体的制备 501
11.9.1 基本方案通过化学偶联法用MB5 将合成肤偶联到载体蛋白上 501
11.9.2 备择方案用戊工醒将合成肤通过化学偶联法交联到载体蛋白上 502
2章 DNA 蛋白质相互作用 503
12.1 从哺乳动物细胞中制备核和细胞质提取物 505
12.1.1 基本方案核提取物的制备 505
12.1.2 辅助方案1 细胞核提取方法的优化 508
12.1.3 辅助方案2 细胞质（S-100） 组分的制备 508
12.2 DNA 结合在凝肢电泳中的迁移率变动分析 509
12.2.1 基本方案迁移率变动分析 510
12.2.2 备择方案1 竞争迁移率变动分析 512
12.2.3 备择方案2 抗体超变动分析 512
12.2.4 备择方案3 多元迁移率变动分析 513
12.3 用来分析蛋白质-DNA 相互作用的甲基化和尿嘧啶干扰分析法 514
12.3.1 基本方案1 甲基化干扰分析法 514
12.3.2 基本方案2 尿嘧啶干扰分析法 515
12.4 DNA 酶I足迹分析法 517
12.4.1 基本方案DNA 酶I足迹滴定 518
12.4.2 辅助方案用光密度及数值分析法决定蛋白质结合的平衡常数 520
12.4.3 辅助方案租制品的DNA 酶足迹分析法 522
12.5 蛋白质与核酸的紫外交联 524
12.5.1 基本方案用澳脱氧尿苷（ BrdU）取代的探针进行紫外交联 524
12.5.2 备择方案1 用非澳脱氧尿苷（BrdU）取代的探针进行紫外交联 526
12.5.3 备择方案2 原位紫外交联 527
12.6 用生物素/链霉亲和素亲和系统纯化DNA 结合蛋白 527
12.6.1 基本方案用生物素/链霉亲和素亲和系统纯化DNA 结合蛋白 527
12.6.2 备择方案1 用微型柱进行纯化 527
12.6.3 备择方案2 用链霉亲和素琼脂糖进行纯化 530
12.7 编码DNA 结合蛋白的cDNA 克隆的检测、纯化和鉴定 530
12.7.1 基本方案用位点识别DNA 筛选gtll表达文库 531
12.7.2 备择方案用盐酸阻进行干燥膜的变性/复性循环 533
12.7.3 辅助方案从重组溶源菌中制备粗提物鉴定DNA 结合蛋白的活性 533
12.8 用克隆化基因在体外合成的蛋白质分析DNA-蛋白质相互作用 535
基本方案 535
12.9 序列特异性DNA 结合蛋自的亲和层析纯化 536
12.9.1 基本方案1 DNA 亲和介质的制备 536
12.9.2 备择方案将DNA 偶联于澳化氨活化的琼脂糖上 539
12.9.3 辅助方案1 用制备性凝肢电泳纯化寡核苷酸 539
12.9.4 基本方案2 DNA 亲和层析法 541
12.9.5 辅助方案2 非特异竞争性DNA 的选择和制备 543
12.10 PCR 辅助的结合位点选择确定蛋白质-DNA 序列的特异性 544
12.10.1 基本方案 544
12.10.2 备择方案从迁移率变动凝肢中分离和分析结合的寡核苷酸 548
3章 酿酒酵母 550
13.1 酵母菌培养基的制备 551
13.1.1 液体培养基 552
13.1.2 固体培养基 554
13.1.3 菌株的保存与复苏 557
13.2 酵母菌的培养与操作 558
13.2.1 基本方案1 液体培养基培养 558
13.2.2 基本方案2 固体培养基培养 559
13.2.3 基本方案3 细胞密度检测 559
13.2.4 基本方案4 影印平板检测酵母菌表型 559
13.2.5 基本方案5 交配型的确定 559
13.2.6 菌株的构建和四分体抱子的分析 560
13.2.7 辅助方案解剖针的制作 565
13.2.8 备择方案随机抱子分析 565
13.3 酵母菌基因组转座子的诱变 566
13.3.1 战略计划 567
13.3.2 基本方案利用mTn诱变文库DNA 得到酵母菌突变体 567
13.3.3 辅助方案1 小载体聚合酶链反应 569
13.3.4 辅助方案2 mTn 诱变基因产物的表位标记 571
13.4 酵母菌载体与克隆基因表达产物的检测 573
13.4.1 基本方案1 构建lacZ融合载体研究酵母菌基因调控 573
13.4.2 基本方案2 半乳糖苷酶在被体培养基中的检测 573
13.4.3 备择方案利用滤纸提取检测法筛选表达β半乳糖苷酶的酵母菌落 574
13.5 将DNA 导人酵母细胞 575
13.5.1 基本方案乙酸铿转化 575
13.5.2 备择方案电穿孔转化 576
13.5.3 辅助方案单链高分子质量载体DNA 的制备 578
13.6 利用互补作用克隆酵母菌基因 579
基本方案 579
13.7 酵母细胞中质粒的加工 581
13.7.1 基本方案1 从酵母细胞中分离质粒 581
13.7.2 基本方案2 穿梭质粒 581
13.7.3 基本方案3 定位突变质粒缺口修复技术和等位基因修复技术 583
13.8 克隆化酵母DNA 的加工 584
13.8.1 基本方案1 整合性转化 584
13.8.2 基因置换技术 585
13.8.3 基本方案5 一步整合置换产生修饰基因 589
13.8.4 备择方案2 通过移换产生修饰基因 590
13.8.5 基本方案6 通过铜诱导双重关闭技术产生条件等位基因 590
13.9 酵母DNA 的制备 592
13.9.1 基本方案从酵母菌中快速分离质粒DNA 592
13.9.2 备择方案酵母染色体DNA 的快速分离 593
13.10 酵母菌RNA 的制备 594
13.1 0.1 基本方案热酸性酣抽提法制备酵母RNA 594
13.10.2 备择方案I 玻璃珠制备RNA 595
13.10.3 备择方案2 poly （A）+ RNA 的制备 595
13.11 制备酵母蛋白抽提物 596
13.11.1 基本方案原生质球制备及裂解 596
13.11.2 辅助方案差速离心法制各细胞核 597
13.11.3 备择方案1 玻璃珠破细胞法 598
13.11.4 备择方案2 液氮破细胞法 598
4章 原位来交和免疫组织化学 600
14.1 组织、胚胎及单细胞的固定、包埋及切片 601
14.1.1 基本方案组织和胚胎的多聚甲醛固定及石蜡包埋 601
14.1.2 备择方案悬潭及培养细胞的PFA 固定 602
14.1.3 辅助方案1 成年小鼠的灌注 603
14.1.4 辅助方案2 蜡块中样本的切片 604
14.1.5 辅助方案3 包被载玻片的制备 605
14.2 冰凉切片 605
14.2.1 基本方案样本制备及切片
14.2.2 辅助方案1 用于原位杂交的冰冻切片的固定 608
14.2.3 辅助方案2 组织固定和直在糖灌注 609
14.3 细胞RNA 的原位杂交 609
14.3.1 基本方案细胞的石蜡切片杂交实验 610
14.3.2 备择方案冰冻切片的杂交 613
14.3.3 辅助方案1 合成35 s-标记的核糖核酸探针 614
14.3.4 辅助方案2 35 S 标记的双链DNA 探针的合成 616
14.4 杂交探针的检测 616
14.4.1 基本方案1 胶片放射自显影 616
14.4.2 基本方案2 乳胶放射自显影 616
14.4.3 辅助方案蝴才自显影用稀释享L脏的制备 617
14.5 放射自显影原位杂交玻片的复染和压片固定 618
14.5.1 基本方案吉姆萨（Giemsa） 染色 618
14.5.2 备择方案1 苏木精/伊虹染色
14.5.3 备择方案2 甲苯胶蓝染色 620
14.5.4 备择方案3 HOECHST 染包法 620
14.6 免疫组织化学法 621
14.6.1 基本方案1 单层生长细胞的免疫荧光标记 623
14.6.2 备择方案1 悬浮细胞的免疫荧光标记 623
14.6.3 基本方案2 组织切片的免疫荧光标记 624
14.6.4 备择方案2 链霉亲和素生物素结合物免疫荧光标记 625
14.6.5 备择方案3 组织切片的免疫金标记 626
14.6.6 备择方案4 组织切片的免疫过氧化物酶标记 626
14.6.7 备择方案5 组织切片的免疫荧光双标记法 627
14.7 用非同位素探针进行原位杂交和检测 627
14.7.1 基本方案荧光原位杂交 627
14.7.2 杂交信号的放大 629
14.7.3 非同位素标记探针的酶法检测 631
14.8 原位PCR 和杂交检测低丰度的靶核酸 633
14.8.1 总体设计 633
14.8.2 基本方案1 用RNA 的原位逆转录进行DNA 和RNA 靶序列的ISPCR 扩增 636
14.8.3 备择方案一步法逆转录及扩增 640
14.8.4 基本方案2 ISPCR 扩增的靶产物的杂交和检测 641
14.8.5 辅助方案1 AES 浸泡处理载玻片的制备 644
14.8.6 辅助方案2 在载玻片上制备原位PCR 样本 645
14.8.7 辅助方案3 用33 P 标记寡核苦酸探针 646
14.9 RNA 在脊椎动物的胚胎和器官中的整体标本原位杂交和检测 646
14.9.1 基本方案1 小鼠或者鸡的胚胎以及椿宫中的整体原位杂交 647
14.9.2 基本方案2 小鼠胚、鸡胚或者器官中RNA 杂交的酶学检测 648
14.9.3 备择方案1 非洲爪瞻的整体原位杂交 650
14.9.4 备择方案2 非洲爪瞻胚胎RNA 杂交的酶学检测 652
14.9.5 辅助方案1 地高辛标记的RNA 探针的合成 653
14.9.6 辅助方案2 用胚胎预吸收Fah 片段 654
14.10 荧光显微镜的原理及使用 655
14.10.1 荧光分子探针 657
14.10.2 滤光器以及撞光设备 657
14.10.3 多频带的滤镜和多燃料荧光 658
14.10.4 光源 658
14.10.5 显微镜的物镜
14.10.6 图片分辨率和点散布函数（PSF） 659
14.10.7 活细胞的荧光显微镜检术 660
14.10.8 兔疫标记2 标记固定细胞和组织的一般步骤 661
14.11 共聚焦显微术基本原理 664
14.11.1 光分割的原理 666
14.11.2 共聚焦显微镜的类型 667
14.11.3 实际操作指南 669
14.12 原位杂交的测量 675
14.12.1 基本方案通过磷光核存储影像决定原位杂交中的时才性同位素标记的异摞双链体的分布 675
14.12.2 辅助方案制备参考体系 677
14.13 细胞凋亡的形态：生化性质和流式细胞仪检测 678
14.13.1 基本方案I 使用活体荧光染料的显微镜定量凋亡指数和细胞活力 678
14.13.2 基本方案2 用次Go /Gl DNA 峰值计算细胞凋亡 680
14.13.3 基本方案3 用TUNEL 流式细胞定量凋亡细胞 681
14.13.4 基本方案4 通过TUNEL 组织切西中的凋亡细胞的原位杂交 683
14.14 冉半乳糖苷酶活性的整体封片免疫组化检测 684
14.14.1 基本方案~半乳糖苦酶活性的整体封片染色和免疫组化检测 684
14.14.2 备择方案准备大组织的厚切片进行β半乳糖苷酶染色 686
14.14.3 辅助方案1 保存和组织清洗 686
14.14.4 辅助方案2 石蜡包埋、切片和染色 687
S章 黯合酶链反应CPα） 689
15.1 PCR 扩增DNA：标准程序和优化 690
基本方案PCR 扩增DNA：标准程序和优化 690
15.2 利用PCR 产物直接进行DNA 序列测定 696
15.2.1 基本方案1 不对称PCR 产生的单链产物的双脱氧测序 697
15.2.2 备择方案1 单引物重复扩增制备单链模板以用于双脱氧测序 697
15.2.3 备择方案2 制备用于双脱氧测序的双链PCR 产物 698
15.2.4 备择方案3 用噬菌体外切核酸酶消化双链PCR 产物得到单链进行双脱氧测序 699
15.2.5 基本方案2 用于化学测序的PCR 产物的标记 699
15.2.6 备择方案4 PCR 产物的基因组测序 700
15.3 用于基因组测序及足迹分析的连接介导PCR 701
15.3.1 基本方案连接介导的单侧PCR 701
15.3.2 辅助方案1 从单层细胞制备用于DMS 足迹分析的基因组DNA 705
15.3.3 辅助方案2 从悬浮细胞中制备用于DMS 足迹分析的基因组DNA 708
15.3.4 辅助方案3 用于化学测序的基因组DNA 的制备 709
15.4 PCR 产物的分子克隆 711
15.4.1 基本方案产生T-A 凸出端 711
15.4.2 备择方案产生半位点 713
15.5 PCR 扩增RNA （RT-PCR） 714
15.5.1 基本方案在*适条件下进行RNA 的PCR 扩增 714
15.5.2 备择方案1 避免长时间的共沉淀及复性步骤的方法 716
15.5.3 备择方案2 将cDNA 直接用于扩增步骤 716
15.5.4 辅助方案粗制RNA 的快速提取 717
15.6 利用单侧PCR （锚式PCR） 进行cDNA 扩增 717
15.6.1 基本方案1 扩增己知序列的下游（3'端）区段 717
15.6.2 基本方案2 扩增己知序列上带（ 5'端）区段 721
15.7 通过PCR 方法对微量DNA 进行定量分析 723
基本方案 723
6章 蛋白质的表达 726
16.1 蛋白质在大肠杆菌中的表达概述 727
16.2 T7 噬菌体RNA 聚舍酶/启动子表达系统 730
16.2.1 基本方案用双质粒系统进行表达 730
16.2.2 备择方案1 质粒编码蛋白的选择'性标记 732
16.2.3 备择方案2 通过M13 噬菌体mGP1-2 感染的表达 733
16.3 融合蛋白载体表达概述 734
16.4 融合蛋白的酶解和化学裂解 736
16.4.1 基本方案1 用Xa 困子进行融合蛋白的酶解 736
16.4.2 辅助方案用b 因子进行变性融合蛋白的裂解 737
16.4.3 备择方案1 用凝血酶进行融合蛋白的酶解 738
16.4.4 备择方案2 与分离介质结合的GST 融合蛋白的酶解 738
16.4.5 备择方案3 用肠激酶进行融合蛋白的酶解 739
16.4.6 基本方案2 用澳化氧对融合蛋白进行化学降解 740
16.4.7 备择方案4 用提脏化学裂解融合蛋白 741
16.4.8 备择方案5 低pH l水解融合蛋白进行化学裂解 741
16.5 谷脏甘肤-s-转移酶融合蛋白的表达及纯化 742
基本方案 谷脱甘肽-5-转移酶融合蛋白的表达及纯化 742
16.6 硫氧还蛋白融合蛋白的表达和纯化 745
16.6.1 基本方案硫氧还蛋白融合蛋白的构建和表达 745
16.6.2 辅助方案1 用弗氏细胞压碎器裂解大肠杆菌 748
16.6.3 辅助方案2 硫氧还蛋白融合蛋白的渗透性释放 750
16.6.4 辅助方案3 用热处理纯化硫氧还蛋白 750
16.7 杆状病毒表达系统的概述 751
杆状病毒表达系统 751
昆虫细胞中蛋白质的翻译后修饰 753
用杆状病毒表达系统超量表达蛋白质的步骤 753
选择杆状病毒转移载体 753
16.8 昆虫细胞培养的保存及重组杆状病毒的产生 757
16.8.1 基本方案1 昆虫细胞的保存和培养 757
16.8.2 基本方案2 用线性化杆状病毒DNA 共转染昆虫细胞 759
16.8.3 备择方案用野生型杆状病毒DNA 共转染产生重组病毒 761
16.8.4 基本方案3 杆状病毒储液的制备 764
16.8.5 基本方案4 用噬斑试验测定病毒储液的滴皮 765
16.9 用杆状病毒系统表达和纯化重组蛋白 767
16.9.1 基本方案1 用于*初分析的小规模表达 767
16.9.2 辅助方案1 蛋白质生产高峰期的确定 76 8
16.9.3 辅助方案2 重组蛋白的代谢标记
16.9.4 基本方案2 重组蛋白的大规模生产 770
16.9.5 基本方案3 含有多聚组氨酸标签重组蛋白的纯化 771
16.9.6 备择方案含有GST 标签重组蛋白的纯化 772
16.10 概述：蛋白质在哺乳动物细胞中表达 773
16.10.1 病毒介导的基因转移 774
16.10.2 瞬时表达
16.11 用cos 细胞瞬时表达蛋白质 778
基本方案 778
16.12 症苗病毒表达系统概述 780
16.13 细胞系和症苗病毒储液的制备 783
16.13.1 基本方案1 贴壁细胞的培养 784
16.13.2 基本方案Z 悬浮细胞的培养 785
16.13.3 基本方案3 症苗病毒储液的制备 786
16.13.4 辅助方案1 噬斑分析测定症苗病毒储液的滴度 787
16.13.5 基本方案4 鸡胚成纤维细胞的制备 788
16.13.6 基本方案5 MVA 病毒储液的制备 789
16.13.7 辅助方案2 用免疫染色法滴定MVA 病毒 790
16.14 重组症苗病毒的制备 792
16.14.1 基本方案1 症苗载体转染（瘟苗病毒）感染的细胞 792
16.14.2 辅助方案1 症苗病毒的纯化 796
16.14.3 辅助方案2 症苗病毒DNA 的提取 798
16.14.4 基本方案2 筛选重组病毒噬斑 799
16.14.5 基本方案3 噬斑扩增 801
16.14.6 基本方案4 重组MVA 的活体免疫染色 803
16.14.7 辅助方案3 用刀豆蛋白A包被组织培养板 804
16.15 重组症苗病毒及其产物的鉴定 804
16.15.1 基本方案1 应用PCR 方法检测症苗DNA 805
16.15.2 基本方案2 应用Southem 杂交检测症苗病毒DNA 807
16.15.3 基本方案3 应用斑点杂交检测症苗病毒DNA 808
16.15.4 备择方案应用点印迹检测表达的蛋自质 809
16.15.5 基本方案4 应用免疫印迹检测表达蛋自 810
16.15.6 基本方案5 应用免疫沉淀栓测表达蛋白 811
16.16 用症苗病毒/T7 RNA 聚合酶系统表达基因 812
16.16.1 基本方案1 重组症菌病毒（vTF7-3） 感染后的脂质体转染 813
16.16.2 基本方案2 两种重组瘟苗病毒共感染细胞 815
16.16.3 基本方案3 单病毒感染OST7-1 细胞 816
16.16.4 基本方案4 利用VOTE 系统进行基因表达 817
16.16.5 辅助方案脉冲标记检测表达的蛋白质 818
16.17 自主调节的四环素控制系统诱导基因表达 819
16.17.1 基本方案磷酸钙介导的pTet-tTAK 稳定转染NIH3T3 细胞和四环素调控的靶质粒 820
16.17.2 辅助方案分析目的基因的蛋白质表达 823
16.18 从哺乳动物细胞中表达和纯化抗原决定簇标记的多亚基蛋白复合体 825
16.18.1 基本方案1 从组成型表达FLAG 标记蛋白的克隆化细胞系中纯化多亚基蛋白复合物 826
16.18.2 基本方案2 从条件性表达FLAG 标记蛋白的克隆化细胞系中纯化多亚基蛋白复合体 829
16.18.3 备择方案变化起始材料和挽脱条件纯化抗原表位标记蛋自复合体的多种形式 831
16.18.4 辅助方案用P11 离子交换层析柱纯化多种形式的抗原表位标记的蛋白复合体 834
7章 蛋白质磷酸化的分析 836
17.1 蛋白质磷酸化概述 837
17.2 32 目标记培养细胞和制备用于免疫沉淀的细胞裂解物 838
17.2.1 基本方案培养细胞的32 Pi 标记和温和去垢剂裂解法 838
17.2.2 备择方案SDS 煮沸法裂解细胞 840
17.3 磷酸氨基酸分析 841
17.3.1 基本方案磷酸氨基酸的酸水解和双向电旅分析 841
17.3.2 备择方案碱处理提高转移至滤膜上的含磷酸酶氨酸和磷酸苏氨酸的蛋白质的检测灵敏度 844
17.4 分析非标记蛋白质的磷酸化作用 845
17.4.1 基本方案1 用抗磷酸醋氨酸抗体和标记蛋白A 进行免疫印迹分析 845
17.4.2 备择方案用增强化学发光法（ECL） 检测结合的抗体 846
17.4.3 基本方案2 磷酸酶消化法鉴定磷酸化的蛋白质 847
17.5 酶法检测磷酸化作用 848
17.5.1 基本方案1 用非特异酸性磷酸酶精化磷酸蛋白质 848
17.5.2 备择方案1 用非特异碱性磷酸酶捕化磷酸蛋白质 849
17.5.3 基本方案2 用丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶消化磷酸蛋白质 850
17.5.4 备择方案2 用酶氨酸磷酸酶消化磷酸蛋白质 850
17.5.5 辅助方案离解32 P的测量和鉴定 851
17.6 特异性识别酷氨酸磷酸化肤的抗体的制备 851
17.6.1 基本方案1 抗磷酸肤的多克隆抗体的制备 851
17.6.2 基本方案2 抗磷酸肤的单克隆抗体的制备 854
17.6.3 辅助方案1 肤的合成 856
17.6.4 辅助方案2 将肤链交联到AFFI-GEL 10 亲和介质上 856
17.6.5 辅助方案3 将磷酸酶氨酸交联到AFFI-GEL 10 亲和介质上 858
17.7 用外源性底物分析蛋白激酶 859
17.7.1 基本方案1 环核苷酸依赖性蛋白激酶的分析 861
17.7.2 基本方案2 蛋白撒酶C 异构体的分析 862
17.7.3 基本方案3 用--酶蛋白进行酷蛋白撒酶的分析 863
17.7.4 备择方案用多肤底物进行酷蛋白激酶的分析 863
17.7.5 基本方案4 Ca2+ I钙调蛋白依赖性激酶的分析 864
17.7.6 基本方案5 醋氨酸撒酶的分析 865
17.7.7 基本方案6 在凝肢中直接进行激酶的分析 866
17.7.8 辅助方案1 用于激酶分析的细胞裂解方案 867
17.7.9 辅助方案2 三氯乙酸沉淀法测定放射性物质的掺入率 868
17.7.10 辅助方案3 P81 磷酸纤维素膜的吸附 868
17.8 研究蛋白质磷酸化的渗透策略 870
17.8.1 基本方案用渗透细胞进行蛋白磷酸化的分析 871
17.8.2 备择方案1 用于SDS-PAGE 的天然细胞样品制备 873
17.8.3 备择方案2 制备用于等电聚焦的夭然细胞样品 874
17.9 磷酸肤图谱和磷酸化位点的鉴定 874
17.9.1 基本方案1 用SDS-聚丙烯酷股凝肢分离的蛋白质的膜蛋白酶磷酸肤图谱 875
17.9.2 备择方案固相化蛋白质的水解消化 881
17.9.3 辅助方案1 从纤维素平板上提取磷酸肤 882
17.9.4 基本方案2 用于工EDMAN 降解法测定肤中磷酸化氨基酸的位置 883
17.9.5 基本方案3 第二次鉴别性捎化以检测磷酸肤中特定氨基酸的存在 885
17.9.6 辅助方案2 用于微序列测定或质谱的磷酸肤的制备 886
8章 生物信息学 888
18.1 用BLAST 程序组进行序列相似性搜索 888
18.1.1 BLAST 概述 889
18.1.2 搜索策略 907
第四章蛋白质相互作用的分析 912
19.1 利用相互作用阱/双杂交系统鉴定相互作用蛋白 915
19.1.1 基本方案1 鉴定诱饵蛋白 916
19.1.2 基本方案2 相互作用蛋白的捕获 923
19.1.3 备择方案1 相互作用阱的快速筛选 931
19.1.4 备择方案2 通过相互作用交配进行捕获实验 932
19.1.5 辅助方案1 用于免疫印迹分析的蛋白质提取物的制备 934
19.1.6 辅助方案2 制备蛙精载体DNA
19.2 与GST 融合蛋白结合的蛋白质的亲和纯化 937
19.2.1 基本方案GST 融合蛋自的亲和纯化 937
19.2.2 辅助方案E.coli提取物的制备 937
19.3 基于噬菌体表达克隆来确认相互作用蛋白质 940
基本方案相互作用克隆 941
19.4 表面等离子共振技术 944
19.4.1 基本方案1 使用BIAcore 芯片的表面等离子共振 944
19.4.2 基本方案2 使用NTA-SAM 芯片的表面等离子共振 946
19.5 用共沉淀法检测蛋白质一蛋白质之间的相互作用 946
19.5.1 基本方案用蛋白A/G-琼脂糖共沉淀蛋白 946
19.5.2 备择方案用GST 融合蛋白共沉淀 947
19.6 用Far Western 分析识别蛋白质相互作用 948
19.6.1 基本方案用Far Western 分析蛋白质混合物 949
19.6.2 备择方案1 用免疫印迹技术检测相互作用蛋白质 950
19.6.3 备择方案2 在Far Western blot 中用多肤检测特定的相互作用序列 951
第20章 染色质的装配与分析 953
20.1 微球菌核酸酶分析染色质结构 954
20.1.1 基本方案1 渗透化细胞的染色质的徽球菌核酸酶消化 954
20.1.2 基本方案2 分离的细胞核的染色质的微球菌核酸酶消化 955
20.1.3 基本方案3 纯化的基因组DNA 的微球菌核酸酶消化 957
20.1.4 辅助方案1 染色质消化得到的DNA 的纯化和鉴定 957
20.1.5 辅助方案2 核酸酶切割图谱分析策略 959
20.1.6 辅助方案3 使用改进的LM-PCR 方法在核苷酸水平上检测MNase 对双链的切割 961
20.2 分离Triton/乙酸/尿素聚丙烯酷胶凝胶电泳分离组蛋白变体和翻译后修饰异构体 962
20.2.1 基本方案组蛋白的Tritonl乙酸/尿素聚丙烯酣睡凝肢电泳分析 963
20.2.2 辅助方案1 凝肢板的组装 964
20.2.3 辅助方案2 从制备的核中分离组蛋白 965
20.2.4 辅助方案3 TAU-聚丙烯酣睡凝脏的电转移 966
20.3 用免疫共沉淀的方法从总细胞抽提物中确定与染色质结合的蛋白质 967
基本方案用免疫共沉淀的方法从细胞总抽提物中确定与染色质结合的蛋白质 967
20.4 从哺乳动物细胞中分离组蛋白和核小体核心 967
20.4.1 基本方案1 精核的制备 967
20.4.2 基本方案2 去H1 的寡聚刷、体的溶解和纯化 972
20.4.3 基本方案3 单聚及二聚核小体的纯化 974
20.4.4 基本方案4 握磷灰石层析法纯化核心组蛋白 975
20.5 用盐透析的方法组装核小体模板 975
20.5.1 基本方案1 用逐步盐透析的方法组装核小体模板 976
20.5.2 基本方案2 用梯度盐透析的方法组装高浓度的单核小体 977
20.5.3 基本方案3 用梯庭盐透析的方法组装核小体串 978
20.5.4 辅助方案1 细菌的重组核心组蛋白的纯化 979
20.5.5 辅助方案2 用于单核小体组装的单链5'端标记的DNA 的制备 980
20.5.6 辅助方案3 用于组装高浓度非标记的单核小体的DNA 的制备 981
20.5.7 辅助方案4 用于核小体串组装的DNA 的制备 982
20.5.8 辅助方案5 用琼脂糖凝肢电掠分析重建复合体 982
20.5.9 辅助方案6 用聚丙烯酿腊凝肢电泳分析重建复合体 983
20.5.10 辅助方案7 通过EcoRI 消化确定G5E4核小体串组装的革围 983
20.6 使用果蝇系统进行染色质重组 984
20.6.1 基本方案1 果蝇5-190 染色质重组抽提物的制备 984
20.6.2 基本方案2 从果蝇胚胎中纯化核心组蛋白 984
20.6.3 基本方案3 用5-190 抽提物进行染色质重组 988
20.6.4 基本方案4 重组的果蝇ACF 的表达和纯化 990
20.6.5 基本方案5 重组的果蝇NAP-l 的表达和纯化 991
20.6.6 备择方案1 重组的果蝇NAP-l 的表达和纯化（NTA Surperflow 树脂） 993
20.6.7 基本方案6 使用重组的果蝇因子进行染色质装配 993
20.6.8 备择方案2 重组染色质装配反应中的核心组蛋白与DNA 比率的滴定 995
20.6.9 辅助方案果蝇拓扑异构酶I 的核心催化区域的表达和纯化 996
第21章 核酸阵列 998
21.1 核酸阵列概述 998
21.1.1 微阵列擅长做什么？ 998
21.1.2 核酸阵列还能够做什么？ 1000
21.1.3 关于数据分析 1001
21.1.4 哪里有更多的信息？ 1002
21.2 用于表达分析的mRNA 的制备 1003
21.2.1 策略安排 1003
21.2.2 基本方案用于表达监测以及与寡核苦酸芯片杂交的mRNA 扩增 1004
21.2.3 辅助方案1 对照基因的体外转录和转录库的制备 1008
21.2.4 备择方案cDNA 和体外转录产物的回相可逆固定（SPRI）纯化 1010
21.2.5 辅助方案2 cDNA 定量 1011
21.3 用cDNA 阵列技术检测人的基因表达谱 1012
21.3.1 基本方案1 cDNA 扩增和影印 1012
21.3.2 基本方案2 RNA 抽提和标记 1016
21.3.3 基本方案3 杂交和数据处理 1019
21.3.4 辅助方案1 EST 的琼脂糖凝肢电泳 1021
21.3.5 辅助方案2 荧光法测定DNA 浓度 1023
21.3.6 辅助方案3 多聚赖氨酸封闭玻片 1023
第22章 组合文库的建立和使用 1025
22.1 构建组合库及文库所用的DNA 库的设计、合成和扩增 1025
22.1.1 基本方案1 随机序列库的纯化 1025
22.1.2 辅助方案1 库的复杂度的测定 1026
22.1.3 辅助方案2 库的偏好性的测定 1028
22.1.4 辅助方案3 库扩增的小规模PCR 反应的优化 1028
22.1.5 基本方案2 库DNA 的大规模扩增 1029
22.2 肤适配体z 用于细胞过程的正向及反向分析的显性遗传学试剂 1031
22.2.1 基本方案1 构建硫氧还蛋白肤适配体组合库 1031
22.2.2 基本方案2 利用双杂交系统相互作用阱/筛选特定蛋白的肤适配体 1033
22.2.3 基本方案3 通过相互作用交配确定识别特异性 1035
22.2.4 基本方案4 肤适配体的亲和力成熟 1036
22.2.5 基本方案5 用肤适配体正向分析细胞过程 1038
22.2.6 辅助方案肤适配体靶点的鉴定 1039
22.3 利用mRNA 显示法进行蛋白筛选 1040
22.3.1 基本方案1 制备和纯化mRNA 显示蛋白 1040
22.3.2 基本方案2 mRNA 显示蛋白的纯化和逆转录 1044
22.3.3 基本方案3 RNA 显示蛋白的筛选与扩增 1046
22.3.4 辅助方案1 FLAG 标签的纯化 1050
22.3.5 辅助方案2 诱导突变PCR 1050
第23章 单个细胞或-群细胞间差异表达基因的发现和分析 1052
23.1 差减cDNA 文库的建立 1052
基本方案差减cDNA 文库的构建 1052
23.2 基于PCR 的差减cDNA 克隆 1056
23.2.1 基本方案差躏cDNA 文库的构建 1056
23.2.2 辅助方案狭锺斑点杂交监测差减过程 1062
23.3 mRNA 的PCR 差异显示 1064
基本方案mRNA 的PCR 差异显示 1064
23.4 限制性内切核酸酶介导的差异显示（RMDD） 1067
23.4.1 基本方案RMDD 文库的准备和两轮扩增 1068
23.4.2 备择方案两阶段PCR 扩增 1073
23.4.3 辅助方案直接印迹电泳 1074
23.5 基于AFLP 的转录表达谱分析 1077
基本方案基于AFLP 的转录表达谱分析 1077
23.6 基因表达系列分析（SAGE） 1083
23.6.1 基本方案基因表达系列分析（SAGE） 1083
23.6.2 辅助方案1 PCR 验证cDNA 产物 1094
23.6.3 辅助方案2 优化双标签的PCR 扩增 1095
附录1 试剂和溶渡 1097
附录2 实用测量值和数据 1247
附录3 生物化学和分子生物学常用技术 1264
附录3A 凝胶和印迹实验中放射性标记蛋白和DNA 的检测及定量 1264
附录3B 玻璃器皿的硅化 1271
附录3C 透析与超滤 1271
附录3D 用吸收光谱法和荧光光谱法定量DNA 和RNA 1277
附录3E 通过沉默突变引人限制性内切核酸酶识别位点 1280
附录3F 哺乳动物细胞组织培养技术 1282
附录3G 安全使用放射性同位素 1290
附录3H 分子生物学家的统计学：组比较 1300
附录4 试剂和设备的供应商 1323
附录5 参考文献 1368
索引 1385