现代仪器分析实验技术(第二版)(下册)

第13章 紫外-可见光谱分析 13.1 概述 紫外-可见光谱法(ultraviolet-visible spectrometry，UV-VIS)是研究在200～800 nm波长内的分子吸收光谱的一种方法。它广泛地用于无机和有机质的定性和定量测定，其灵敏度和选择性较好。紫外-可见光谱法使用的仪器设备简单，易于操作。 分子吸收紫外-可见光获得的能量足以使价电子发生跃迁，因此由价电子跃迁产生的分子吸收光谱称为紫外-可见光谱或电子光谱。紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的，所以又称为电子光谱。由于电子跃迁的同时，伴随着振动能级和转动能级的跃迁，所以紫外光谱为带状光谱。紫外吸收光谱的波长范围是10～400nm，其中10～200 nm为远紫外区(这种波长的光能够被空气中的氮、氧、二氧化碳和水吸收，因此只能在真空中进行研究，所以这个区域的吸收光谱称真空紫外)，200～400 nm为近紫外区，一般的紫外光谱是指近紫外区。波长在400～800nm范围的称为可见光谱。常用的分光光度计一般包括紫外及可见两部分，波长在200～800 nm(或200～1000 nm)。 紫外-可见分光光度法有如下特点：①仪器和操作简单、费用成本低、速度快；②灵敏度高，*低检出浓度可达10–6 g/mL；③精密度和准确度较高，其相对误差可达到1%～2%，这满足了对微量组分的测定要求；④选择性较好；⑤用途广泛，广泛用于化工、环境等方面。 紫外-可见光谱不仅可以进行定量、定性及结构分析，还能进行配合物的组分及稳定常数、官能团鉴定、分子量测定等。 紫外吸收光谱在生产、科研的众多领域有着十分广泛的应用，主要应用于物质的定性分析、定量分析、纯度检测、化合物结构的推测、氢键强度的测定几个方面。近年来，随着生物科学研究的发展，用波谱技术在分子水平上研究生命过程的分子运动和变化规律成为前沿领域的热门话题，波谱法测定生物分子的技术也得到快速发展。紫外-可见光谱具有光明的应用前景，相信随着紫外-可见光谱的应用技术的加深，必将在众多领域改变我们的生活，带来巨大的利益。 13.2 仪器构成及原理 13.2.1 仪器基本构成 1. 光源 对光源的基本要求是应在仪器操作所需的光谱区域内能够发射连续辐射，有足够的辐射强度和良好的稳定性，而且辐射能量随波长的变化应尽可能小。在紫外-可见分光光度计中有热辐射光源和气体放电光源两类。热辐射光源用于可见光区，如钨丝灯、卤钨灯和汞灯，可用范围在340～2500 nm。气体放电光源用于紫外光区，如氢灯、氘灯和氙灯，可在160～375 nm范围内产生连续光源。氘灯一般是紫外光区应用*广泛的一种光源。 2. 单色器系统 单色器是一个完整的色散系统，并组成仪器的核心部分，决定着仪器的主要光学特性和工作特性。其作用是将光源发出的白光色散成不同波长的单色光，并从出射狭缝中导出照于样品上。仪器除了棱镜或光栅色散元件外，还有入射、出射狭缝及一组反射镜。由工作光谱性能指标如范围、分辨率、色散率等，分别选用不同的单色器如棱镜或光栅分光、双联、滤色片分光等等。 1)滤光片 在仪器中，滤光片通常是用来消除单色器的杂散光。其特性可以用*大透光波长和谱带半宽度来表征。它是*简单、*廉价的单色装置。但基于单色性不理想，大大限制了测定精度。滤光片分为带通滤光、中性滤光、干涉滤光、截止滤光以及标准滤光片五种。 2)单色器 从宽波长的光源辐射中分出单一波长的光学装置叫单色器。由色散元件、入射狭缝、出射狭缝和准直镜等部分组成。单色器质量的优劣取决于色散元件的质量。 A. 狭缝 狭缝是由具有锐利刀口的两片金属片精密加工制成的，包括入射和出射狭缝，是单色器的重要组成部分，关系到分辨率的优劣。光源的光进入色散系统前，要先经过一个入射狭缝，使光成为一条细的光束照射到准直镜上，反射后成为平行光投射到棱镜或光栅上进行色散。出口狭缝出来的光并不是某一单波长的光，狭缝越宽所包含的光波越多，狭缝越窄杂散光的影响越小，但是光的亮度也越弱。 B. 棱镜 棱镜是从紫外到中红外区的比较合适的色散元件，其光谱纯度主要取决于棱镜的色散特性和光学设计。紫外范围内通常采用硅。可见范围内常用光学玻璃代替。本生(Bunsen)和利特罗(Littrow)是常用两种形式的棱镜单色器，棱镜的主要缺点是色散波长的非线性分布。 C. 光栅 光栅分透射光栅和反射光栅，是用于紫外、可见、近红外范围内十分重要且应用范围很广的色散元件。透射光栅的母光栅的生产需要很精密的装置，要在一块透明材料或玻璃上刻一系列平行的紧紧相靠的凹槽，较贵。故而用较便宜的复制光栅代替，性能上虽次于母光栅，但能满足应用。反射光栅则是喷涂铝薄膜于复制光栅表面制成。光栅的单位长度刻线越多，分辨率越高，色散也越大。另外在闪耀光栅中，闪耀波长内光栅有*大能量输出。光栅的缺点是有次级光谱干扰，且杂散光的影响比棱镜大，因此常配滤光片以去除。光栅单色器的排列方式尽管有几种，但通常采用的一种是埃伯特于1889年发明的。原理是一个球面镜准直和聚焦，对称地放置两个狭缝，让波长的选择通过旋转光栅来实现。因其昂贵，现代仪器常采用采尼(Czerny)和特纳(Turner)改进的，一种结构紧凑的用两个小球面镜来代替大而昂贵的埃伯特球面镜的单色器。 3. 吸收池 吸收池又称比色皿或比色杯，紫外-可见分光光度计常用的吸收池有石英和玻璃两种。石英吸收池可用于紫外光区和可见光区，玻璃吸收池只能用于可见光区。吸收池的种类很多，其光径可在0.1～10 cm之间，常用的石英吸收池光程一般为1 cm，玻璃吸收池有0.5 cm、1 cm、2 cm、5 cm等多种。同一台分光光度计上的比色杯，其透光度应一致，在同一波长和相同溶液下，比色杯间的透光度误差应小于0.5%，使用时应对比色杯进行校准。 4. 检测器 检测器的作用是检测光信号，并将光信号转变为电信号。现今使用的分光光度计常用的检测器是光电接收元件，有光电倍增管(利用外光电效应与多级二次发射体相结合而制成的光电器件，放大倍数可达108倍，其积分灵敏度远远超过充气光电管，且与真空光电管一样有非常好的线性关系，是目前应用很广的紫外和可见区极灵敏的探测元件)、光敏电阻和光电池作为检测器。 5. 信息处理与显示系统 显示系统是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表获取信息并显示出来的装置。常用的信号显示装置有直读检流计、微安表、电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示器和计算机等。检流计和微安表可显示透光度(T%)和吸光度(A)。数字显示器可显示T%、A和C(浓度)。通过计算机与分光光度计相联，光谱数据可立即显示，绘制谱图，而且还可进行多种类型的数据处理。 13.2.2 紫外-可见光谱基本原理 紫外-可见吸收光谱遵从朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即 (13-1) 式中，k为吸光物质的本性，与入射光波长及温度等因素有关；c为吸光物质浓度；l为透光液层厚度。朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。 1. 理论基础 紫外-可见吸收研究的是分子内原子在平衡位置附近的振动、分子绕其重心的转动和价电子运动。所以分子的能量E等于以上三项之和： (13-2) 式中，Ee、Ev、Er分别代表电子能、振动能和转动能。 分子从外界吸收能量后，就引起分子能级的跃迁，即从基态能级跃迁到激发态能级。分子吸收能量具有量子化的特征： (13-3) 紫外-可见吸收光谱是由分子中的电子跃迁产生的。按分子轨道理论，在有机化合物分子中这种吸收光谱取决于分子中成键电子的种类、电子分布情况，根据其性质不同可分为三种电子：①形成单键的σ电子；②形成不饱和键的π电子；③氧、氮、硫、卤素等杂原子上的未成键的n电子。如图13-1所示。 图13-1 基团中的σ、π、n电子 当它们吸收一定能量ΔE后，将跃迁到较高的能级，占据反键轨道。分子内部结构与这种特定的跃迁是有密切关系的，使得分子轨道分为成键σ轨道、反键σ*轨道、成键π轨道、反键π*轨道和n轨道，其能量由低到高的顺序为：σ<>　　图13-2 分子轨道中的能量跃迁示意图 这些跃迁分为以下几种： (1)N→V跃迁：由基态轨道跃迁到反键轨道(包括σ→σ*跃迁和π→π*跃迁)； (2)N→Q跃迁：分子中未成键n电子激发跃迁到反键轨道(包括n→σ*跃迁和n→π*跃迁)； (3)N→R跃迁：σ键电子逐步激发到各个高能级上，*后脱离分子，使分子成为分子离子的跃迁(光致电离)； (4)电荷迁移跃迁：当分子形成配合物或分子内的两个大p体系相互接近时，外来辐射照射后，电荷可以由一部分转移到另一部分，而产生电荷转移吸收光谱。 因此，有机化合物价电子可能产生的主要跃迁为σ→σ*、n→σ*、n→π*和π→π*。各种跃迁所需能量大小为： n→π*跃迁：当不饱和键上连有杂原子(如羰基、硝基)时，杂原子上的n电子能跃迁到π*轨道。n→π*跃迁是四种跃迁中所需能量*小的，它所对应的吸收带位于200～400 nm的近紫外区。如果带杂原子的双键基团与其他双键基团形成共轭体系，其n→π*跃迁产生的吸收带将红移，例如丙酮的n→π*跃迁在276 nm，π→π*跃迁在166 nm，而4-甲基-3-戊烯酮的两个相应吸收带分别红移至313 nm和235 nm。但是n→π*跃迁是禁阻跃迁，所以吸收强度很弱。 n→π*跃迁：不饱和键中的π电子吸收能量跃迁到π*反键轨道。π→π*跃迁所需能量较n(p*跃迁的大，吸收峰波长较小。孤立双键的π→π*跃迁产生的吸收带位于160～180 nm，仍在远紫外区。但在共轭双键体系中，吸收带向长波方向移动(红移)。共轭体系越大，π→π*跃迁产生的吸收带波长越长。例如，乙烯的吸收带位于162 nm，丁二烯为217 nm，1， 3， 5-己三烯的吸收带红移至258 nm。这种因共轭体系增大而引起的吸收谱带红移是因为处于共轭状态下的几个π轨道会重新组合，使得成键电子从*高占据轨道到*低空轨道之间的跃迁能量大大降低。 σ→σ*跃迁：是氧、氮、硫、卤素等杂原子的未成键n电子向σ反键轨道跃迁，当分子中含有—NH2、—OH、—SR、—X等基团时，就能发生这种跃迁。n电子的n→σ*跃迁所需能量较大，偏于远紫外区，一般出现在200 nm附近，受杂原子性质的影响较大。 σ→σ*跃迁：是单键中的σ电子在σ成键和反键轨道间的跃迁。因σ和σ*之间的能级差*大，所以σ→σ*跃迁需要较高的能量，相应的激发光波长较短，在150～160 nm范围，落在远紫外光区域，超出了一般紫外分光光度计的检测范围。 电荷迁移跃迁：用光照射化合物时，电子从给予体向与接受体相联系的轨道上的跃迁称为电荷迁移跃迁。这种跃迁谱带较宽，吸收强度大。 无机化合物产生的跃迁主要为电荷迁移跃迁和配位场跃迁。紫外-可见光谱一般是指近紫外区(200～400 nm)和可见区(400～800 nm)，只能观察n→π*和n→π*跃迁，也就是说只适用于分析分子中具有不饱和结构的化合物。如图13-3所示。 图13-3 电子跃迁所处的波长范围及强度 2. 紫外-可见光谱中常用的名词术语 发色团(chromophore)：也称生色团，是指在一个分子中产生紫外吸收带的基团，一般为带有π电子的基团。有机化合物中常见的生色团有羰基、硝基、双键、三键以及芳环等。发