整合课程基础实验(分子与细胞分册)

**章 基本实验操作及常用仪器使用 **节 常用研究技术 一、分光光度技术 每种物质均具有特异性的吸收光谱，不同物质由于分子结构的差异，对不同波长光线的吸收能力不同。凡是以光吸收、发射和散射等作用而建 立起来的光分析方法，称为光谱分析法。分光光度技术就是一种常见的光谱分析方法，它利用物质特有的吸收光谱，对物质进行定性及定量的鉴定 分析。它不仅可应用于可见光，还可以扩展到紫外和红外光谱。对于未经分离纯化的复杂样品，分光光度技术可直接检测出其中极少量的物质成分 ，体现出高灵敏度、高精确度和快速简便的特点。目前，分光光度技术已经成为生物化学工作中不可或缺的常用技术之一。 (一)基本原理 光由光量子组成，具有波-粒二相性，即不连续的微粒和连续的波动性。光的本质就是电磁波，分光光度法所使用的光谱范围在200～10 000nm 之间。其中200～400nm为紫外光区，400～760nm为可见光区，760～10 000nm为红外光区。分光光度技术的定量依据是比尔-朗泊(Beer-Lambert)定 律，简称比尔定律，也称为光吸收定律。当一束平行单色光通过一定液层厚度的有色溶液时，由于溶质吸收了光能，光的强度就会减弱。溶液浓度 越大，液层厚度越大，入射光越强，则光被吸收的就越多，光强度的减弱现象越明显。比尔定律正好描述了有色溶液对单色光的吸收程度与溶液及 液层厚度间的定量关系，即溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。用公式表示： A=E×C×L (1-1) 式中，A为吸光度；E为吸光系数；C为溶液浓度；L为液层厚度；E是各物质在一定波长下的特征常数，可反映物质对光吸收的灵敏程度。E值越 大，表示该物质对此波长的光吸收能力越强。 比尔定律适用于有色溶液和均匀非散射的吸光物质(包括液体、气体和固体)，是各类分光光度法的定量依据。 (二)分光光度计基本结构 从含有各种波长的混合光中分离并测量单色光强度的仪器称为分光光度计。由于分光光度计采用具有辐射连续光谱的光源，不同波长的分子吸 收光谱的强弱存在差异。因此，根据不同波长设计的分光光度计具有各自的用途和测定范围，常用于测定分子光谱的分光光度计有三大类，即紫外 分光光度计，可见光分光光度计和红外分光光度计。另外，还有万用(全波段)分光光度计。分光光度计由下列五部分组成，包括光源、单色器、狭 缝、样品池、检测器和显示器。 1. 光源 光谱仪器使用的光源配置的光源，必须提供所需波长范围的连续光谱，并具备足够的输出功率和良好的稳定性。 常用的紫外光源有氢灯和氘灯，分别发射波长在190～360nm和180～500nm之间的光谱。由于氘灯辐射能量比氢灯大约4倍，使用寿命也比氢灯 长，目前大多数紫外分光光度计都使用氘灯。 常用的可见光光源有碘钨灯、钠灯和疝灯等。钨灯发射连续波长的范围在320～2500nm之间；钠灯发射连续波长的范围在400～10 000nm之间； 疝灯发射连续波长的范围在250～700nm之间。 常用的红外光光源有纳恩斯特(Nernst)棒，这是一种通过电加热使温度达到1500～2000℃之间的惰性材料。它的检测波长范围在750～1 000 000nm之间。 2. 单色器 能将连续复合光源分解成单一波长的单色光或者具有一定宽度谱带的分光器，称为单色器。单色器由分光器和狭缝等色散元件组成 。 单色器由棱镜或者光栅构成。棱镜的分光原理是，当一束平行光进入棱镜散射器后就会按波长顺序分解成单一波长的单色光。经聚焦镜聚焦后 ，在聚焦面的不同位置上成像，就得到按波长展开的光谱。光学玻璃棱镜，主要用于可见分光光度计或红外分光光度计；石英玻璃棱镜主要用于紫 外分光光度计；人造蓝宝石棱镜，其用途与石英玻璃棱镜相同。棱镜的特点是波长越短，色散程度越好。所以用棱镜的分光光度计，其波长刻度在 紫外区可达0.2nm，而在长波段只能达到5nm。光栅利用光的衍射和干涉原理进行分光，即在石英或玻璃的表面上刻划许多平行线，刻线处不透光， 于是通过光的干涉和衍射现象，较长的光波偏折的角度大，较短的光波偏折的角度小，因而形成光谱。光栅单色器的性能优劣取决于光栅的材料和 单位面积上刻的条纹数量，刻得越多则分辨率越高。 3. 狭缝 狭缝是单色器的重要组成部分，直接影响仪器的分辨率。狭缝由两块锋利金属刀片(一块弧形，一块直形)组成，两刀片之间严格平行 。由此在光通路上形成狭隙，将来自单色器的散射光切割成单色光，调节入射单色光的纯度和强度。狭缝越大，采集光的面积越大，光的单色性越 差。反之，则光的单色性越好。狭缝可在0～2mm宽度内调节，较先进的分光光度计的狭缝宽度可随波长一起调节。 4. 样品池 样品池也叫做比色杯或比色皿，由透明材料制成，比如硅酸盐玻璃、有机玻璃、石英玻璃或其他晶体材料。不同的检测波长可选用 不同材料制成的比色杯，例如在紫外光波区检测可选用石英玻璃比色杯，在可见光波区可选用普通光学玻璃比色杯，在中红外和远红外光波区可选 用无机盐晶体材料制成的比色杯。样品池用来盛放溶液，每个样品池壁厚度等规格应尽可能完全相同，否则将产生测量误差。 5. 检测器 检测器也被称为光电转换器，主要功能是将光信号转变为电信号，再通过放大器把信号输送给显示器。检测器必须在一个较广的波 长范围内对辐射信号都有响应，尤其在低功率辐射时对辐射能的吸收要更敏感，对辐射的响应更快，转换的电信号容易放大，产生的噪声要小，生 成的信号与入射光强度成正比。 光子响应检测器又分为光电光检测器、光电倍增管检测器、二极管列阵检测器。其中，光电管是由密封在玻璃管或石英玻璃管内的两个金属电 极组成，包括一个阴极和一个阳极。光电管的光谱响应特性取决于阴极上的涂层材料，不同阴极材料制成的光电管使用光谱范围不同，在不同的波 区测定光谱辐射，需选择不同的光电管。阴极是用对光敏感的金属(比如碱土金属的氧化物)制成。光越强，电子放出越多，由于电子带负电，被吸 引到阳极上而产生电流。光电管产生电流很小，需要放大。分光光度计采用电子倍增光电管，在光电管的阴极和阳极之间增加了若干倍增电极，故 在光照射下产生的电流比其他光电管要大很多，因此可提高测定的灵敏度。 6. 显示器 显示器是将检测器产生的光电流以某种方式转变成模拟数字结果，再以一定方式显示出来。模拟输出装置包括电流表、电压表、记 录器、示波器、计算机联用等。一般多功能的精密分光光度计大多数采用软件配套的计算机显示。 (三)分光光度计的基本应用 1. 利用标准管测定溶液物质的含量 可见和紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。含量测定时所用波长通常要选择被测物质的*大 吸收波长。这样做的好处是检测灵敏度大，物质在含量上的细微变化都将引起吸光度的明显改变，并且可避免其他物质的干扰。 对已知浓度的标准管和测定管进行同样的处理和显色，分别读取吸光度，再根据公式(1-1)计算测定管中物质的含量，计算过程如下： A1 ＝ E1C1L1 A2 ＝ E2C2L2 (1-1) 其中A1和A2分别表示标准溶液和未知浓度溶液的吸光度，C1和C2分别表示标准溶液和未知浓度溶液的物质浓度，L1和L2分别表示盛放标准溶液 和未知浓度溶液比色杯的内径长度。其中L1=L2，故将上述两个公式改写为： A1/(E1C1)＝ A2/(E2C2)(1-2) 鉴于标准溶液和待测溶液中的物质相同，故E1=E2，将公式(1-2)简写为： C2 ＝(A2/A1)× C1(1-3) 考虑到标准溶液和待测溶液的体积相同，将公式(1-3)简写为： m2 ＝(A2/A1)×m1(1-4) 其中m1和m2分别表示标准溶液和待测溶液中物质的含量，应用公式(1-4)可计算出待测溶液中物质的含量m2。 2. 绘制标准曲线测定溶液物质的含量 对一组梯度浓度的标准管处理显色后，读取每管吸光度。以溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制 标准曲线，在选定浓度范围内标准曲线应为直线。然后，在与标准管相同处理的条件下，测定未知浓度溶液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相 对应的浓度。 一般而言，标准曲线的浓度范围在待测物质浓度的0.5～2倍之间，对应的吸光度应在0.05～1.00之间。另外，应在同一台仪器上进行标准曲线 的绘制与应用，绘制的标准曲线仅供短期使用，否则结果存在误差。 3. 通过摩尔吸光率推算溶液物质的浓度 比尔定律公式中的E为吸光系数，当溶液浓度C为1mol/L，液层厚度L为1cm时，E值等于摩尔消光率， 用ε表示，单位为L/(mol cm)。ε是物质的特征常数之一，由物质的性质与光波长决定。同一物质在不同的波长所测得的ε值不同，一般采用ε 值*大的波长进行比色测定。 读取液层厚度为1cm时的溶液吸光度，结合已知的ε值，根据公式(1-5)推算出待测溶液的物质浓度： C ＝ A/ε(1-5) 该方式是紫外吸收法测定蛋白质溶液含量的基础。蛋白质在280nm波长处有*大吸光值，其高低与蛋白质中赖氨酸和色氨酸的含量有关，故同 样浓度不同类型的蛋白质在280nm波长处具有不同的吸光值。在一定条件下，蛋白质的摩尔吸光率是一个恒定值。测出待测蛋白质溶液的吸光值， 即可根据公式1-5推算出待测蛋白的浓度。 紫外分光光度计适用于单一组分的物质或两个组分组成的混合物(两者的吸收峰完全独立)的定量分析，但对于存在某些干扰杂质的样品，则需 进行校正。例如，蛋白溶液中若混有核酸成分，则需采用280nm/260nm的吸光度比值校正，才能确定溶液中蛋白质的实际含量。 4. 测定混合物中各组分的浓度 面对含有2种或2种以上组分的待测溶液，根据各组分吸收光谱的重叠程度，选择不同的测定方法。例如，待测 溶液各组分的吸收峰互不干扰，则可按照单一组分测定方法分别测定各组分的浓度；各组分的吸收峰相互重叠，则可在多波长的光照射下，分别测 定其波长处溶液的表观吸光度，然后建立联合方程式，通过解方程获得各组分的浓度。 5. 鉴定化合物的种类 使用分光光度计可绘制吸收光谱曲线。方式是采用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一 种单色光的吸光度，然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制吸光度-波长曲线，即吸收光谱曲线。各种物质具有特定的吸收光谱曲线，因此 可通过吸收光谱曲线图鉴定化合物。特定化合物在不同浓度时，其吸收光谱曲线中，峰值的大小不同，但形状相似，吸收高峰和低峰的波长是固定 不变的。 紫外吸收光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度分析，比如用于蛋白质的定量分析(如前所述)。紫外线吸收是由化合物中的不饱和结构 造成的，含有双键的化合物表现出吸收峰。紫外吸收光谱比较简单，同一化合物的紫外吸收光谱应完全一致。值得注意的是，具有相同吸收光谱的 化合物其结构不一定相同。因此紫外吸收光谱分析需和其他方法结合起来确定化合物的种类。 (张莹) 二、电泳技术 在电场作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极方向以一定的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，称为电泳。在一定条件下，混合物 中各组分的大小、携带电荷等不同，在同一电场下经过一段时间的泳动，就可有效的分离各组分。电泳技术就是由各种带电颗粒在电场中迁移率不 同而进行分离的一种技术。生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散于溶液中，它们所携带的静电荷主要取决于基质的H+浓度。以蛋白质 分子为例，蛋白质分子具有许多可解离的酸性基团和碱性基团，在一定非等电点条件下，就会解离带电，蛋白质分子的性质和溶液的pH及离子强度 共同决定了它的带电的性质和电荷量 。带电的蛋白质分子在电场中就会朝着其所带电荷相反的方向移动，