蛋白质工程

**章 绪论 **节 蛋白质工程概论 蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。蛋白质是构成组织细胞的主要材料，人的大脑、神经、皮肤、肌肉、内脏、血液，甚至指甲、头发都是以蛋白质为主要成分构成的。蛋白质的功能是构成组织与修补组织，这充分体现了蛋白质的重要性。蛋白质在生物界与非生物界的信息交流中起着关键的作用。 目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。因此，有学者称，蛋白质工程是第二代基因工程。其基本实施目标是运用基因工程的DNA重组技术，将克隆后的基因编码加以改造，或者人工组装成新的基因，再将上述基因通过载体引入挑选的宿主系统内进行表达，从而产生符合人类设计需要的“突变型”蛋白质分子。这种蛋白质分子只表达人类需要的性状。 实际上，蛋白质可以是一种营养品、一种致病源物质、一种治病良药、一种生产材料。它们各具有不同的结构和功能，应用于社会生产的不同方面。可是，生物体内存在的天然蛋白质，往往在不同领域的应用上不尽如人意，需要进行改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。由于蛋白质是两性电解质，每一种蛋白质有自己独特的pH和等电点，因此改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质所带电荷特性，进而改变蛋白质的性质。 蛋白质工程学是以蛋白质优质和高效生产的方法论为研究与创新的科学。从广义上来说，蛋白质工程应是以蛋白质为原材料，进行生产性为主的、建设性的、对蛋白质进行合理利用的过程。在这个过程中人们需要改造蛋白质，对蛋白质进行修饰与加工，通过物理、化学、生物如基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。 一、蛋白质工程的内涵 1. 优质和高效生产的方法研究 蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。对植物、动物组织进行大规模地高效率提取蛋白质，或者应用植物、动物细胞及原核细胞进行发酵培养，表达外源蛋白质，高效提取生产蛋白质药物，是工业蛋白质生产的工程改进过程。利用基因工程技术可使目标蛋白在体外进行表达。选择高效表达的优良体系是优质生产的重要手段。已知一种新的表达载体：可选择抗体的丝状噬菌体fd载体（antibody-selectable filamentous fd phage vector），它能将外源短肽表达并伸展到噬菌体的表面，可以用亲和筛选法筛选表达特异肽序列的噬菌体，通过测定噬菌体的DNA序列，就可以知道所表达的肽段的氨基酸序列。因此，通过改变蛋白质的生产方式，或者通过修饰生产符合要求的蛋白质，以及大量的生产，以满足社会对产品的要求。 2. 改良蛋白质的方法与技术体系研究 蛋白质的改造，从简单的物理、化学法到复杂的可调控生物合成、随机肽库、定位突变与基因重组等有多种方法。蛋白质工程的技术包括基因工程技术和非基因工程技术。非基因工程技术主要指蛋白质氨基酸序列的化学修饰、体外化学合成，以及组合体外合成与化学改性技术改良天然蛋白质或筛选非天然突变蛋白质及其大规模生产的技术，如大豆蛋白纺丝技术。 蛋白质中的氨基酸是由基因中的三联密码决定的，只要改变其中的一个或两个就可以改变氨基酸。通过改变某个位置的氨基酸，可以改进蛋白质的结构、稳定性或催化特性。利用基因的定点突变技术可以对外源基因进行改变，然后再表达突变后的产物，可用于研究蛋白质的结构与功能，筛选新的蛋白质。 3. 蛋白质改良中分子技术的应用 合理设计是蛋白质工程中使用的分子技术，而且现在也在广泛的使用。要达到此目的要做好3个方面的工作：①要用结晶学技术来获得蛋白质结晶体，然后利用X 射线技术对晶体进行测量、分析，确定蛋白质的三维结构；②要借助计算机对蛋白质进行选择修饰，从氨基酸的化学结构预见空间结构，或者通过人工智能等其他方法来确定蛋白质和功能的关系，找到要修饰的位点；③通过对基因序列的了解，运用定点突变技术来进行碱基替换。通过此法可以改变蛋白质的功能，但要想获得理想的蛋白质工程产物往往要经过多次分析、替换才能达到目的。 定向进化是蛋白质工程的新策略，它是在不需要事先了解蛋白质的空间结构的情况下通过模拟自然进化机制，以改进的诱变技术结合确定进化方向的选择方法。定向进化实际就是随机突变加上选择，它与自然进化不同，整个过程都是在人为控制下进行的，并且还可以模拟真核细胞中DNA随机拼接这一蛋白质进化过程来加速蛋白质的优化。因此，它能解决合理设计所不能解决的问题，在工业生产中的应用越来越受到重视。 4. 蛋白质开发与应用新途径的研究 近年来，生物分子固定化技术—直是生物、化工、制药等领域研究的热点之一。固定化生物分子的种类繁多，由*初的蛋白质逐渐扩展到酶、多肽、氨基酸、DNA、RNA、抗体等具有生物活性的分子。随着微生物固定化技术地不断发展，各类新型生物传感器不断涌现，产生了微生物电极传感器。自聚集和基因工程又提供了对大量分子或集合体进行复杂控制和处理的方法。生物电子器件可提供更有价值的潜力。由于细菌视紫红质（bR）分子极好的物理和光学特性，变得稳定的bR质子成为高记录密度的磁记录介质的一个可替代记录介质。 二、广义蛋白质工程 广义蛋白质工程，实际上是广泛的蛋白质优质生产和高效利用的方法学研究，包括蛋白质的分离纯化技术，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基因重组或其他手段改造或创造蛋白质，以及蛋白质分子识别和蛋白质光电特性利用工程等。 1. 蛋白质的分离纯化技术 蛋白质的分离纯化技术是用生物工程下游技术从混合物中分离纯化出所需要的目的蛋白质的方法。它是当代生物产业当中的核心技术，技术要求与成本都较高。例如，一个生物药品的成本75%都用于下游蛋白质分离纯化当中。因此，蛋白质的分离纯化技术依然需要改进与发展。其常用技术有：各种沉淀技术、各种电泳技术、透析技术、各种层析技术等。 2. 蛋白质结构和功能的分析 *先要测定蛋白质的一级结构，其次进行结构的物理测定。物理测定主要有：X射线晶体学、核磁共振及冷冻电子显微学。除了核磁共振以外，还有一些生物化学技术被用于测定二级结构，包括圆二色谱。冷冻电子显微技术是近年来兴起的一种获得低分辨率（低于5A）蛋白质结构的方法。 3. 蛋白质结构和功能的设计和预测 当前蛋白质结构预测方法为比较建模法、折叠识别法、二级结构预测法和从头预测方法，前3项是基于已有知识，后一项是从头预测。按照其对模板的依赖与否主要分为两类：模板依赖模型（template-based modeling）和从头预测方法（ab initio）[或称自由模型（free modeling）]。模板依赖模型又可以分为两种模型：同源模型（或称比较模型）和折叠识别模型（又称穿线法）。当目标序列没有同源结构时，进行蛋白质三维结构预测就必须使用从头预测方法。 4. 通过基因重组改造或创造蛋白质 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的核糖核苷酸序列（RNA）→找到相对应的脱氧核糖核苷酸序列（DNA）。这是狭义的蛋白质工程，此后论述。 5. 蛋白质分子识别 分子印迹技术是制备具有分子识别能力聚合物的技术，由于具有构效预定性、特异识别性和广泛实用性三大特性，而在分离纯化、生物化学、生物药学及医学等许多领域具有广阔的应用前景。分子印迹技术（molecular imprinting，MIT）是指为获得在空间和结合位点上与目标分子（模板分子、印迹分子）完全匹配的聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）的制备技术。蛋白质印迹聚合物是一种人工模拟抗体，与生物抗体相比较，具有对高温、酸、碱耐受性强，在苛刻条件下可操作性及制作成本低、可重复使用等优点，目前已经在以下3个方面得到应用：①色谱分离；②抗体或受体模拟；③生物传感器。 6. 蛋白质光电特性利用工程 在信息时代的今天，数字化运算是信息处理的必要手段。用细菌视紫红质（简称菌紫质，bacteriorhodopsin，BR）膜进行光逻辑运算是目前研究热点之一。菌紫质具有一系列特殊的光电和光学特性。菌紫质具有光致变色响应特性，即菌紫质在进行光循环过程中处于不同的中间态时所呈现的颜色各不相同。菌紫质在接受光照后，电极两端会生成感应电动势或在外接电路中产生位移电流。经测定，光照后会产生正的瞬时脉冲电流，并逐渐降到稳定值。当光照停止后，又会产生负的脉冲电流，正、负光电信号同时随光照强度的变化而变化，这就是菌紫质的光电响应效应。科学工作者经过长年累月的实验、分析和总结，现已初步摸清了它的本质，其快速光致变色响应特性已达到秒级（10-12s）水平，空间分辨率极高，并且具有超常的耐热性，尤其让人青睐的是它易于大量制取且不需采取特殊的保存手段。 三、狭义蛋白质工程 狭义蛋白质工程，特指应用基因工程的方法获得蛋白质优质生产和高效利用的方法学研究。它是从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的核糖核苷酸序列（RNA）→找到相对应的脱氧核糖核苷酸序列（DNA），进行基因工程学研究与改进。 1. 定点突变技术 定点突变技术（site-directed mutagenesis）是在已知DNA序列中取代、插入或删除特定的核苷酸，从而改变酶的结构中的个别氨基酸残基的技术。定点突变有的是改变特定的核苷酸，有的则是对一段*可能影响酶的功能与性质的基因序列进行随机突变，从而产生一系列突变酶分子。定点突变技术有多种方法，如寡核苷酸引物介导的重组PCR 定点突变法、限制性内切核酸酶酶切片段取代法、盒式突变法和化学全合成法等。定点突变是在已知酶的结构与功能的基础上，有目的地改变酶的某一活性基团或模块，从而产生新性状的酶，故又称理性分子设计。 2. DNA改组技术 DNA改组技术（DNAshuffling）是体外同源重组的一种再组装PCR 技术。它是将一群密切相关的序列，在DNaseⅠ作用下，随机酶切成许多片段，这些小片段之间有部分重叠碱基序列，通过自身引导PCR （self-priming PCR），使这些小片段重新组装成全长基因，建立突变文库，对突变文库进行筛选，选择改良的突变体组成下一轮DNA改组的模板，重复多次重排与筛选，直到获得性状较为满意的突变体。 3. 体外定向进化技术 定向进化的主要目的是在短时间内，获取想筛选的突变体，即定向进化等于随机突变加高通量筛选。酶的体外定向进化（direction evolution of enzyme in vitro），又称分子进化（molecular evolution），就是在实验室模拟自然进化机制（随机突变、重组和自然选择），通过容错PCR （error-prone PCR）等方法，对编码酶的基因进行随机诱变，再通过高通量筛选或选择方法定向选择出性能更加优良的酶或创造出自然界所没有的而且具有优良性质的新酶。定向进化与定点突变的不同点是它不需要已知酶的结构信息，因此该技术又称非理性设计。 四、蛋白质工程学与其他学科的关系 1. 工程学 工程学是研究自然科学应用在各行业中的应用方式、方法的一门学科，同时也研究工程进行的一般规律，并进行改良研究。它赋予了蛋白质工程学的工科性质及其研究的应用方式、方法。由此，我们定义蛋白质工程学是研究蛋白质优质生产和高效利用的方式与方法的学科。 2. 基因工程 基因工程是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内，并在其中进行表达，它的产品还是该基