高级病理生理学实验技术

**章常用心血管疾病实验动物模型 **节体外分离心房和心室肌细胞 摘要 高质量的心肌细胞分离对于在细胞和分子水平上成功研究心肌功能至关重要。 尽管众多的科研工作己经为不同种类的心肌细胞建立了分离程序，但是要持续得到 存活率高和功能完善的心肌细胞仍然是实验操作过程中面临的严峻挑战。朗根多 夫（Langendorff）逆行灌注技术是从完整心脏分离心肌细胞*成功、*易复现的方 法。在本章节中，我们将详细说明Langendorff分离大鼠心房和心室肌细胞的所有 操作内容。这包括一系列必要的步骤，从快速主动脉插管开始冲洗心脏血液，用不 含钙离子的溶液短时间灌注心脏，然后用含低钙离子的酶溶液长时间灌注，以破坏 细胞外基质网络，提取释放的心肌细胞并温和地重新导入钙离子，使细胞逐渐恢复 到正常的胞质钙离子水平。通过此方案分离的完整存活心室肌细胞得率约为70%（50%～90%）。通常心房肌细胞得率较心室肌细胞低，约10%。心肌细胞得率还取决 于大鼠的年龄和心脏重塑的程度，因此动物年龄较大或发生重构的心脏（更多纤维化）通常会导致较低的得率。分离的心房和心室肌细胞可用于研究心肌细胞功能（如缩短/收缩、细胞内钙离子转化）以及生化和分子生物学研究（如免疫印迹、PCR）。 ―、引言 成功体外分离出成年心肌细胞是在细胞和分子水平上研究和了解心脏生理和病 理机制的重要手段和方法。胚胎心肌细胞和新生心肌细胞的研究不能简单适用于成 年心肌，因为这些细胞在形态和超微结构以及重要离子通道、钙调节和收缩蛋白的 表达方面与成年心肌细胞不同。类似的问题也同样存在于新近发展起来的诱导多能 干细胞衍生而来的心肌细胞。分离的心肌细胞具有不受神经和体液影响的优点，为 高度可控的体外细胞实验提供了理想的实验条件。此外，分离心肌细胞提供了从心 脏不同区域（如左心房或右心房、左心室或右心室、梗死病变区域或心脏传导系统）选择细胞的可能性。高质量的心肌细胞分离对于新分离和培养细胞的成功研究至关 重要，可以通过多种基因转染技术干扰靶基因的表达，从而研究靶基因在心肌细胞 功能调控中的作用和分子机制。 从20世纪70年代至今，各种分离心肌细胞的方法逐步发展起来。哺乳动物的 心肌细胞分离可能因物种差异而有所不同。然而，主要的核心分离过程以及获得功 能完整的、正常钙运作的心肌细胞所涉及的关键因素己经明确。在所有物种中，大 鼠和小鼠可能是分离心肌细胞*常用的动物。Langendorff逆行灌注术是从完整心脏 中分离活心肌细胞的*具重复性和*佳的酶分离技术。这种技术通过主动脉插管对心脏进行灌注，灌注缓冲液在压力下关闭主动脉瓣，与正常生理血流相反（逆行） 沿升主动脉向下流动，从而充盈冠状动脉血管。本文介绍的方案描述了从大鼠心脏 分离心房和心室心肌细胞的过程，并对先前发表的实验方案进行了相应修改。 分离心肌细胞的主要步骤是通过快速主动脉插管进行灌注，使用低钙溶液清洗 出心脏中的血液，用无钙的溶液短暂地灌注心脏，使心肌细胞在闰盘处解离，随后 用含有蛋白水解酶的低钙溶液长时间灌注，从而降解单个细胞与细胞外基质网络的 连接，提取解离的心肌细胞并温和地重新加入钙，使细胞逐渐恢复到正常的细胞液 钙离子水平。 在下文中，我们将详细说明分离大鼠心房和心室心肌细胞的所有步骤，强调成 功制备细胞所需的*关键步骤。 二、实验材料 1.设备 （1）在恒流模式下运行的Langendorff装置、蠕动泵、水浴箱。 （2）解剖用的光学显微镜或放大镜。 （3）—个大小合适的不锈钢套管（直径2～3mm，取决于大鼠的大小）。 （4）外科用丝线（5-0号）、注射器。 （5）剪刀。 （6）镊子、细弯锯齿钳。 （7）300pm筛网、培养皿、盖玻片、Falcon试管。 2.溶液使用超纯水（ddH2O）制备所有溶液，用Milli-QA+超纯水系统处理， 强烈推荐使用18.2Q分子生物学等级的水，所有的分离溶液都应该从基本分离缓冲 液中新鲜制备（表1-1）。 （1）基础分离台氏液（Tyrode’s solution）（见注意事项1）：130mmol/L NaCl，5.4mmol/L KCl，0.5mmol/L MgCl2，0.33mmol/L NaH2PO4，25mmol/L羟乙基哌嗪乙烷磺酸（HEPES），22mmol/L葡萄糖，0.01U/ml胰岛素（pH7.4）。 （2）插管液：含有0.15mmol/LCaCl2和2U/ml肝素的分离台氏液（见注意事项2）。 （3）心脏停搏液（置冰浴）含有25mmol/LKCl的插管液。 （4）无钙溶液：含有0.4mmol/L乙二醇双2-氨基乙醚四乙酸（EGTA）的分离台 氏液（见注意事项3），10mmol/L2，3-丁二酮肟（BDM）和2U/ml肝素。 （5）酶溶液：含有 0.2mmol/L CaCl2，10mmol/L BDM，0.8mg/ml2型胶原酶，0.05mg/ml XW型蛋白酶的分离台氏溶液（见注意事项4）。 （6）心房肌细胞停搏液：含有0.2mmol/L CaCl2， 10mmol/LBDM的分离台氏液。 （7）心室肌细胞停搏液：含0.5mmol/LCaCl2，10mmol/L BDM （见注意事项5），2mg/ml牛血清白蛋白（BSA）的分离台氏液。 （8）钙离子溶液1：含有1mmol/LCaCl2，2mg/mlBSA的分离台氏液。 （9）钙离子溶液2：含有1.5mmol/LCaCU的分离台氏液。 （10）麻醉剂：异氟醚。 （11）层粘连蛋白。 3.动物12～16周龄健康雄性大鼠。 三、实验方法 1.设置Langendorff装置 （1）在分离过程中，Langendorff装置以恒流模式运行。在恒流模式下，心脏的 灌注通过一个蠕动泵来实现，定期检查蠕动泵的流量，并调整到3ml/min，适当的灌 注对于成功的心肌细胞分离非常重要。 （2）Langendorff系统干净、无污染的管道和腔室也是非常重要的因素，每次隔 离后，确保彻底清洗Langendorff系统（见注意事项6）。 （3）打开水浴加热Langendorff系统的套管，使循环灌注液保持在37°C，同时定 期检查灌注液的温度。 （4）将所有用于灌注的溶液充氧以维持足够的O]供应，并防止心脏的缺氧状态 （见注意事项7）。 （5）向Langendorff装置中注入含氧的插管溶液，并避免任何气泡，以防止冠状动脉气栓阻塞。 （6）为了有效地将主动脉固定到套管上，需要选用大小合适的不锈钢套管（直 径为2mm的套管适用于年轻大鼠实验和直径为2.5～3.0mm的套管适用于年龄偏大的大鼠实验）和适当的5-0外科丝线。 2.心脏切除和插管 （1）准备插管设置（图1-1），并在注射器中注入含肝素的插管溶液。清除注射 器中的所有气泡，以防止空气进入冠状动脉。 （2）根据当地动物伦理机构批准的方案麻醉和处死大鼠。在我们的方案中，大 鼠用异氟醚麻醉并脱颈处死。 （3）从中腹到横膈膜切开，用弯曲的锯齿状镊子夹住胸骨，双侧切开。反折胸 腔露出心脏。将肝素溶液（1000U/ml）直接注入心脏（见注意事项8），以防止切除 心脏时血液凝固。 （4）小心地切除周围的非心脏组织，如肺和结缔组织。 （5）用细弯锯齿钳轻轻提起心脏，从胸腔取出心脏，放入含氧的低温心脏停搏 液中，然后轻轻地按压，初步去除一些心脏血液。 （6）将心脏转移到装有含氧冰冷停搏液（见注意事项9）的100mm培养皿中 （图 1-1）。 （7）在确定主动脉和它的头颅分支（通常隐藏在胸腺后面）后，切断它**个分支下面的主动脉，迅速地将心脏滑到主动脉插管上。然后，用手术丝线做一个双 结扎，以确保扎紧，并将插管液注入心脏（图1-1）。 （8）将心脏转移到Langendorff系统（见注意事项10）。 3.心脏灌注和消化 （1）以3ml/min的速率向心脏灌注含氧的无钙溶液，以清除残余血液，当心脏停 止跳动时，表明无钙溶液已经到达心脏。 （2）当无钙溶液到达心脏时，Langendorff仪器的导管应放置在含氧的酶溶液中。4分钟后，酶溶液可以到达心脏（见注意事项11）。 （3）以3ml/min的速率向心脏灌注酶溶液，直到心脏出现肿胀、变软和变苍白 （见注意事项12，图1-2）。当用镊子轻轻地按压时，心室会变形，心脏就像一个袋 子一样悬着（图1-2）。在从心脏表面提取的一滴溶液中，可以发现许多解离的细胞。 心房可能比心室消化得快（约几分钟）。当它们变得松软、苍白且易于取出时，应将 其取下（见注意事项13）。 4.心房肌细胞的制备 （1）取左心房和右心房，分别放入烧杯中，烧杯中加入0.5ml心房肌细胞停搏液，预热至37C。 （2）用两把细镊子轻轻地解剖心房组织（图1-3）。然后将烧杯和心房组织放在摇床上，以促进细胞分离。 （3）根据表1-2中的方案，每2分钟添加一次钙离子浓度增加的溶液，开始缓慢将钙离子浓度升高至正常生理浓度（见注意事项14）。 （4）在钙离子浓度达到正常水平和调整心房肌细胞悬液细胞密度后，将心房肌细胞（图1-4）种在层粘连蛋白（laminin）涂层的盖玻片（或培养皿）上，并将细胞 贴在盖玻片（或培养皿）底部约20分钟，就可以进行后续实验了。 （5）心室肌细胞的制备 1）将心室（见注意事项15）放入烧杯中，用约10ml心室肌细胞停搏液预热至 37C。 2）轻轻地切碎心室（图1-3，见注意事项16）。 3）通过300pm孔径的筛布过滤去除未消化组织（图1-3）。 4）让细胞在重力作用下（图1-3，见注意事项17）静置10分钟，轻轻吸出上清液。