细胞毒性数据挖掘技术与应用(第二版)

第1章细胞电阻抗传感技术概述 　　随着现代科学技术特别是生物医学技术的快速发展，传统以生物活体为主的体内毒性试验方法，因其评测周期长、耗时、费力及伦理问题等缺点，已很难满足对有毒物质高通量筛选的需求[1]。事实上，化学物质产生的损伤和死亡，*终可表现为细胞水平上的改变。根据欧洲标准化委员会CEN1992年30号文件的定义，细胞毒性（cytotoxicity）是指由产品、材料及其浸渍物所造成的细胞死亡、细胞溶解和细胞生长抑制[2]。有研究显示，化学物质体外细胞毒性与其引起的动物死亡率及人体死亡的血药浓度之间都存在良好的相关性[3]。由此推测体外细胞毒性可以预测体内急性毒性，从而选择进行体内毒性实验*适宜的开始剂量，减少实验动物的使用[4，5]。 　　细胞毒性按作用机制可分为三种类型[4]： 　　（1）基本细胞毒性，涉及一种或多种细胞结构或功能的改变，作用于所有类型的细胞； 　　（2）选择细胞毒性，存在于某些分化细胞上，主要通过化学物质的生物转化，与特殊受体结合或特殊摄入机制而引发； 　　（3）细胞特殊功能毒性，对细胞结构和功能损伤轻微，但对整个机体损伤非常严重。类似毒性作用可通过细胞因子、激素及递质的合成、释放、结合和降解影响细胞与细胞间的交流或特殊的转运过程而实现。 　　细胞毒性物质对细胞造成一系列破坏，细胞凋亡的过程很大程度上取决于细胞种类、化学物质的性质、浓度及化学物质作用时间。这些化学物质改变了细胞黏附和形态，这些生物学变化特性可以通过电阻抗变化的方式展现出来，这样通过检测电阻抗变化观察细胞的生物学特性，从而评估细胞毒性大小[6，7]。 　细胞电阻抗传感技术（electric cell-substrateimpedance sensing，ECIS）就是这样一种能够对贴壁生长细胞的形态进行实时、定量监测的独*方法，可在近似生理环境下，通过测量细胞和微电极之间电阻抗的变化来动态地记录细胞增殖、细胞毒性和细胞形态的变化[8，9]。该项技术具备三大特点[10]。 　　（1）无损伤的细胞动态研究平台（不同于染色、标记）； 　　（2）实时定量地进行测量，实时获取数据； 　　（3）实验结果具有高度可重复性，而传统方法对细胞动态行为多数只能采用定性研究。 　　在基础生命科学研究方面，该技术可以用于研究细胞增殖与凋亡、细胞黏附、细胞分化及细胞迁移等。在药物研发方面，主要应用于药物筛选、药效评价、毒理学研究及肿瘤耐药性检测等。 　　1.1细胞电阻抗传感技术背景 　　传统的生物化学检测方法，如基于细胞膜通透性改变的台盼蓝染色法、对细胞核染色的碘化丙啶法、测定细胞酶活性的MTT法、外加标记物法等，确定细胞的存活率时，有如下缺点[11]： 　　（1）需要使用标记； 　　（2）与连续监测不相容（即仅产生终点数据）； 　　（3）与正交试验不相容； 　　（4）无法提供客观、定量的数据。 　　细胞电阻抗传感技术（ECIS）则突破了这些技术的局限，它利用生物组织与器官的电特性及其变化规律，提取与人体生理、病理状况相关的生物医学信息[12，13]。在具体的实现过程中，通常是借助置于体表的电极系统向检测对象送入一个微小电流或电压，检测相应的电阻抗及其变化，然后根据不同的应用目的，获取相关的生理和病理信息[14-16]。目前，生物电阻抗测量技术广泛应用在组织成分活性分析、电阻抗成像、细胞悬液研究以及皮肤诊断中[17]。由于近二三十年的微制造技术的兴起，该技术开始被广泛运用于细胞相关的生物实验，从而促进了ECIS技术的发展。 　　1.1.1细胞电阻抗传感技术简介 　　细胞电阻抗传感技术是细胞培养和阻抗检测技术的结合，在细胞培养过程中，细胞的黏附与伸展是黏附型细胞的基本生长过程。细胞黏附通常涉及大量的细胞与基底表面的相互作用，分为两个阶段，即被动黏附阶段和主动黏附阶段。在被动黏附阶段的起始，细胞的微绒毛与基底表面接触，形成的接触面积只有0.01μm2。几分钟后，成千上万的黏附受体与基底表面接触，形成几个平方微米的基础面积。随着细胞开始变得平坦，与表面的接触面积继续增大。接下来就进入细胞主动黏附阶段，与黏附相关的分子聚集到接触区域，使得黏附强度得到进一步增强，细胞开始在基底表面伸展开来之后，细胞骨架的重组不仅会使细胞膜表面粗糙度增加，还会使细胞形态由圆形变为多边形。为了配合以上的主动黏附过程，细胞体内的蛋白分子和离子会重新排列，呈现不均匀分布，这一变化称为细胞极化。极化后的细胞会伸出板状伪足，与基底附着形成黏着斑。至此，细胞在基底表面的黏附行为才算结束。图1.1所示为细胞在基底表面的黏附过程示意图[18]。 　　活细胞在与基底表面黏附过程中和黏附完成后，表现出各种形式的运动。这些运动可分为三种基本形式：细胞迀移、细胞形态变化、胞内细胞器运动。细胞迀移在癌细胞扩散中起到决定作用；细胞形态变化发生于细胞黏附过程的后期，即主动黏附阶段、细胞分裂成两个子细胞时以及细胞迀移时；胞内细胞器的运动则时刻都在进行，以配合完成各种细胞生理活动。 　　细胞电阻抗传感技术就是将平面电极阻抗测量技术应用于检测细胞形态变化，通过检测细胞组织的电化学过程，从而获取传统方法无法获得的生理变化和细胞的隐藏信息。图1.2所示为细胞阻抗测量原理示意图[19]。检测系统釆用电化学检测中的二电极系统，将细胞培养在导电的工作电极上，由培养液连接对电极，在对电极上施加激励信号，在工作电极上检测到响应信号。工作电极和对电极均釆用了电化学反应惰性较强的金电极，其电阻率低，因此对检测过程的影响以及对检测结果的贡献可以忽略[20，21]。 　　细胞被磷脂双分子层构成的细胞膜包裹着，使得细胞成为电的不良导体，直流电会被细胞膜旁路。当施加一定频率的交流电时，电流流经细胞就会受到一定阻碍，原来可以直接流经电极表面的电极电流，由于电极被培养生长在其表面的细胞所覆盖，而*终只能从细胞侧面通过电阻间隙区域流过，如图1.3所示[21]。 　　这种阻碍反映在响应信号上就是电压变大或者电流变小，总的结果是整个细胞电阻抗传感器的被测阻抗变大。也就是说，细胞黏附到电极表面越多，被测阻抗就越大。除了细胞黏附外，细胞的迀移运动也会引起阻抗值的相应变化。由于施加的电压非常小，电流非常微弱，不会对细胞造成损伤，所以阻抗检测可以贯穿细胞培养的整个过程。因此，ECIS能够完整地记录黏附性细胞在基底表面的黏附和迀移运动的整个过程，并且，这些生命过程伴随着细胞的代谢调节及细胞形态和骨架的变化。 　　根据工作电极数目的不同，细胞阻抗检测系统可以分为单电极体系和阵列电极体系。单电极是指阻抗检测系统只含有一个工作电极和一个对电极，阵列电极体系包含多个工作电极，其中可分为叉指电极和普通阵列电极。 　　叉指电极是阵列电极的一种特殊构型，由多组大小一样、材质相同的条形电极并行排列，并连接到一个共同的末端，形成类似手指交叉的电极阵列结构[22]。在叉指电极中，电极的阻抗在总阻抗中所占比例相等，不区分工作电极和对电极，如图1.4（a）所示。 　　普通阵列电极则含有多个通道，每一个通道含一个工作电极，这些工作电极相互独立，共用一个对电极，利用继电开关在各通道间切换，可以实现多通道的同时测量，如图1.4（b）所示[19]。 　　1.1.2细胞电阻抗传感技术的意义 　　细胞电阻抗传感技术是一项对细胞无损伤，不需要生物标记就可以对细胞黏附和迀移运动进行实时和连续监测的现代技术。此外，细胞电阻抗传感技术对贴壁细胞在体内的生命过程有一定的模拟性，使得检测结果相较于传统方法具有更高的生物学价值。正是由于这些显著的优点和优势，在过去的二三十年里，有关细胞电阻抗传感技术的研究和应用得到了飞速发展，很好地弥补了传统分析方法，如MTT、平板计数法、荧光染色等的不足。细胞电阻抗传感技术作为一种广受欢迎的细胞实验工具，可以用于监测细胞事件，如细胞在各种基底上的黏附和伸展、内皮细胞的屏障功能、细胞微动、细胞迀移和理化因素造成的细胞形态改变等，广泛应用在药学、毒理学和细胞生物学等领域[23-25]。 　　1.1.3细胞电阻抗传感技术发展历程 　　细胞电阻抗传感技术原理由1973年诺贝尔物理学奖获得者Giaever教授及其同事Keese教授，从1984年开始，共同总结并发展至今。 　　1.细胞黏附、伸展、形态和增殖检测方面 　　1984年，Giaever与Keese首次提出细胞电阻抗传感技术，他们将成纤维细胞培养在有小的金工作电极与对电极的培养皿中，测量工作电极与对电极之间的阻抗，结果证实电极所产生的阻抗变化能够反映细胞的黏附和伸展行为[26]。1998年，Keese等更进一步探讨了电极上包裹不同的蛋白质与细胞黏附之间的关系。通过测量工作在不同溶液、不同感测面积条件下电极间的阻抗，推断出阻抗变化反映了细胞对不同的蛋白质有不同的响应[27]。2004年，Keese等研究了哺乳动物的细胞，指出细胞层平均移动1nm就能被ECIS检测到[28]。2000年，Wegener提出了高频电容是反映MDCK细胞早期黏附和伸展*灵敏的参数[29]。Grlmnes与Martinsen采用ECIS技术，通过检测细胞和组织的电化学过程，获得传统方法无法获得的生理变化和细胞的隐藏信息。2002年，Kataoka等结合ECIS和原子力显微术（atomic force microscopy，AFM）研究了单核细胞与内皮细胞相互作用对于内皮细胞微动和力学特性的影响[31]。2003年，Huang等利用阻抗变化反映细胞膜完整性的细胞传感器芯片进行研究，用不同浓度的TritonX-100检测人体前列腺细胞系的细胞膜完整性损坏情况，检测到整个实验期内的细胞动力学过程[32]。 　　2.细胞迁移和浸润方面 　　1997年，Noiri等首次将电阻抗传感技术运用于伤口愈合试验。他们先在电极上施加一个直流电压，使附着在其上的细胞严重电穿孔死亡形成一个伤口[33]。然而，这个直流电压较难控制，有可能会引起电极上的电化学过程而使测量变得不稳定。2004年，Keese等用高频交流信号代替直流电克服了上述缺点，这样形成的伤口大小仅限于微小的电极上，并且不会造成电极损坏，这种方法做出的结果比传统的伤口愈合试验具有更高的可重复性[28]。 　　2008年，Wang等则通过在电极表面修饰形成排斥细胞贴附生长的SAMs膜，等到细胞在器件表面贴附生长稳定后，施加一个直流脉冲破坏SAMs来形成一个伤口，然后细胞便开始往电极上迁移，从而实现了对细胞迁移的实时监测[34]。 　　McCoy和Wang利用ECIS检测了流行性感冒病毒A感染引起的细胞病变。一个健康的单层细胞被流感病毒A感染侵入，被感染细胞形态变圆并且脱附。可通过ECIS检测这些效应导致阻抗变化的情况[35]。 　　3.细胞-受体配体反应监测方面 　　目前研究已经表明基于阻抗的方法能够监测活细胞中受体特异性的激活。表达人组胺受体H1的CHOK1细胞和表达人加压素受体V1a的1321N1细胞分别用组胺和加压素刺激，阻抗测量曲线出现迅速而短暂的升高。细胞固定后用荧光标记，照片结果证实阻抗的变化与肌动蛋白细胞骨架和相关的蛋白的调节有关，此外，能够得到剂量依赖的曲线分析组胺受体激动剂和抑制剂。