超微细胞化学的原理与技术

上篇 超微细胞化学的常用仪器和样品制备技术 　　**章 绪论 　　第二章 透射电子显微镜的结构原理和样品制备技术 　　第三章 扫描电子显微镜的结构原理和样品制备技术 　　第四章 新型的电子显微技术 　　第五章 其他相关仪器的结构原理和应用 　　**章绪论 　　**节细胞化学的定义和发展 　　一、细胞化学的定义 　　细胞化学（cytochemistry）是研究细胞的化学成分及其在细胞活动中的变化和定位的科学。它在不破坏细胞形态结构的情况下，用生化和物理技术对各种组分做定性和定量分析，研究其动态变化，了解细胞代谢过程中各种细胞组分的作用。而组织化学（histochemistry）是指以常用的组织化学技术对细胞内主要化学成分和活性的一般性的研究。细胞化学和组织化学的发展是密不可分的，它们都建立在细胞学、组织学及生物化学的基础上。对细胞中的不同组分进行区别着色是细胞化学中*基础的工作。 　　二、细胞化学的发展 　　19世纪初，法国植物学家拉斯帕伊在研究禾本科植物受精作用时，首次发现了淀粉的碘反应。此后他还建立了蛋白质的黄色反应、硫酸对于糖醛及蛋白质醛基的反应等鉴定方法，因此被认为是组织化学的创始人。 　　1867年，珀尔斯用普鲁士蓝显示细胞中的铁质。1868年，克文克用黄色硫化胺溶液与细胞中的铁质反应生成黑色的硫化亚铁，进行显色反应鉴定细胞中的铁质。1844年，米利翁叙述了蛋白质反应中一种测定酪氨酸的方法。1862年，本克首次将苯胺作为组织化学染料应用于生物组织结构的研究，这是组织学方法上的一次革命。在1868年和1872年，克莱布斯和施特鲁韦分别通过实验显示出组织中酶的存在。1895年，埃尔利希用“纳笛”反应首次显示细胞色素氧化酶。 　　20世纪40年代，随着细胞形态学和生物化学的发展，组织化学、细胞化学迅速发展。1936年，比利时组织化学家利松的《动物组织化学》一书总结了组织化学的优缺点及发展方向，把组织化学推向高潮。 　　当前，发展比较快的是定量细胞化学，其目的是对细胞、细胞组分和细胞产物在其原位上和生活情况下进行定量化学分析，主要包括细胞光度学和原位定量测量两个方面。细胞光度学是对细胞内某些化学物质在光学上的数量进行分析，*常用的方法有吸收量度法、荧光测定法、干涉量度法、反射量度法等。原位定量测量包括对切片厚度的测定、对一个特定细胞化学反应区域的定量测量，以及对放射自显影颗粒的计数和自动影像分析。定量细胞化学虽是细胞化学发展的主要方向，但仍有不少困难。有关仪器方面的问题已逐渐得到解决，但在固定细胞、反应的化学计算方法和反应产物的弥散等方面仍存在不少困难。 　　原位细胞化学所用的方法多是把单层的培养细胞或冰冻切片放在一定溶液内温育，使待测的物质与染料或试剂发生专一性的反应，在原位上直接形成不溶解的产物，用光学显微镜观察产物颜色，或用荧光显微镜观察产物荧光，分析其在细胞内的分布规律和功能。细胞化学对酶的研究一般是将薄的冰冻切片用适宜的底物温育，来测定酶在细胞内的位置。 　　免疫细胞化学是用标记的抗体测定细胞内的抗原，在光学显微镜水平下找出抗原的位置，研究其分布特征和功能的方法。直接显示法的主要步骤是先将组织骤冷，制成薄的切片，然后用偶联的抗血清染色。常用的是间接显示法，其原理是用荧光染料或一种酶标记的第二抗体来加强**抗原-抗体反应。免疫细胞化学方法在细胞生物学中日益显示出重要性，许多细胞骨架蛋白，如微管蛋白、肌动蛋白、调钙蛋白等均可用免疫细胞化学原理找到它们在细胞内的位置。随着生化提纯的蛋白质的增多，免疫细胞化学还会得到更广泛的应用。 　　显微细胞化学样品的观察是在光学显微镜下进行的，由于受到光学显微镜放大倍数和分辨率的影响，使显微细胞化学的应用受到一定程度的限制。20世纪40年代随着电子显微镜的出现及人们对细胞超微结构的认识，建立在细胞超微结构基础上的超微细胞化学技术得到了迅速发展，并且广泛地应用到对细胞结构和功能的研究中。 　　第二节超微细胞化学的研究内容 　　一、生物超微结构的定义 　　人们对生物结构的认识经历了器官、组织、细胞和分子4个水平，其中各种仪器和设备，如光学显微镜、电子显微镜、X射线衍射仪等发挥了重要作用。目前，人们借助各种设备能够从0.1mm的解剖学水平到1nm的原子和分子水平对生物体结构进行全面研究（表1-1）。 　　自从1932年德国的鲁斯卡（Ruska）和诺尔（Knoll）设计并建造了**台电子显微镜以来，人们在电子显微镜下能清楚地观察到细胞的超微结构，甚至一些分子结构。超微结构（ultrastructure）—般指在普通光学显微镜下观察不能分辨清楚的细胞内各种微细结构。“超微结构”一词，严格地讲是指分子水平的结构。目前对介于细胞水平和大分子水平之间的结构，一般称为亚显微结构（submicroscopic structure）或亚细胞结构（subcyto-structure）。但目前一般书刊上所称的亚显微结构、亚细胞结构和超微结构，并无严格的界限。人们往往将普通光镜分辨界限以下的结构笼统地称为超微结构。超微结构常用的单位是微米和纳米（nm）。 　　生物结构的不同层次水平和选择的观察方法见表1-1。 　　二、超微细胞化学的定义 　　超微细胞化学（ultramicro-cytochemistry）又称电镜细胞化学（electron microscopic cytochemistry），它是在显微细胞化学基础上发展起来的、在超微结构水平上的细胞化学。它利用细胞中被研究物质能够选择性地与某些化学试剂发生特异的反应，形成特征性的、不溶的电子致密物的原理，通过电镜观察、识别和定位该物质在细胞超微结构中的分布，从而研究该物质在细胞生命活动中的作用。超微细胞化学能把细胞超微结构及其原位发生的生化反应有机地结合起来进行研究，能揭示细胞的超微结构及其功能之间的内在联系。超微细胞化学内容涉及生物学、化学和物理学等学科，是一门生物学、化学和物理学的交叉学科。 　　三、超微细胞化学的研究内容 　　超微细胞化学涉及的内容很多，包括：细胞中无机物定性、定量及定位的原理和方法；细胞有机物质的定性、定量及定位的原理和方法；生物大分子的结构与功能关系研究等。具体技术有：①电镜酶细胞化学技术；②细胞各成分的检出技术；③示踪细胞化学技术；④特殊染色法；⑤放射自显影技术；⑥免疫细胞化学技术；⑦X射线微区分析技术；⑧其他细胞化学技术，包括扫描电镜细胞化学技术、超高压电镜细胞化学技术等。 　　超微细胞化学技术从原理上可以分为如下几种。 　　（1）沉淀法。当细胞内的物质与适当的试剂（如酶与底物）作用，或者某些金属离子（如焦锑酸和钙离子）彼此间存在化学亲和力时，能形成不溶性的产物，可以用电镜检出。根据观察到的显色电子致密物，能够判断这种物质（如酶）的存在及其在细胞中的确切定位。 　　（2）免疫电镜细胞化学法。组织和细胞内的各种大分子多数具有抗原性，抗原可以借助于电子不透明的标记物（如铁蛋白、酶和胶体金等）标记的抗体而鉴别出来。 　　（3）酶学法。细胞内某些物质本来就是电子致密物，用某种专一酶（或特异的溶剂）能将其分解掉，原有的电子致密物从细胞电镜图像中消失。用这种方法能够反推细胞物质的存在。例如，在组织固定之前先用RNA酶、DNA酶或蛋白酶消化，然后特异染色，在电镜下相应的空白区，就反证了RNA、DNA或蛋白质在细胞中的存在和定位。 　　超微细胞化学反应该满足下列基本要求。 　　（1）反应试剂与细胞内被测物质发生的反应具有特异性。 　　（2）反应不损坏或破坏细胞本身的微细结构。 　　（3）反应的*终产物为电镜能观察到的电子致密物，一般为细小的、稳定的、颜色很深的沉淀物，在细胞原位沉淀；在制样过程中不会改变自己的位置。 　　（4）反应具有可重复性。 　　第三节超微细胞化学在生命科学研究中的应用 　　一、生物科学 　　超微细胞化学可用于动物和植物细胞超微结构研究及功能分析。由于超薄切片技术的出现和发展，人类利用电镜对细胞进行了更深人的研究，观察到了过去无法看清楚的细胞超微结构。在细胞生物学中，超微细胞化学能用于研究细胞内各种细胞器的超微结构、细胞骨架系统和生物膜的超微结构；促进了人们对细胞的结构及其功能（如细胞通讯与运输、细胞分裂与分化、细胞增殖与调控等）的研究。 　　超微细胞化学和电镜技术还可以应用到病毒、细菌和支原体等的超微结构与功能分析，以及病毒发现和识别方面。许多新病毒和类病毒等就是利用电镜发现的。电镜也为病毒的分类提供了*直观的依据。 　　在分子生物学中，超微细胞化学能用于核酸和蛋白质大分子的超微结构研究，并对其进行亚显微测量，还能用于染色体超微结构、DNA转录为mRNA的过程、核酸分子杂交过程等研究。电镜技术与免疫学技术相结合产生的免疫电镜细胞化学技术，可以对细胞表面及细胞内部的抗原进行定位，用于研究免疫球蛋白的分布和功能、蛋白质在细胞中的时空分布变化等。 　　二、农林科学 　　超微细胞化学还可应用于植物保护、土壤改良和成分分析、品种的分类与鉴定和动物疾病的诊断与防治等方面。 　　三、医学科学 　　超微细胞化学可用于超微病理学研究，如病变细胞超微结构变化、病理学的分子基础等。在临床医学中，可用于疑难病症的诊断与治疗，以及对病毒性肝炎、肾病、血液病和肿瘤的分类及诊断。 　　总之，超微细胞化学与生物学、医学和农林科学关系密切，是生物学、医学和农学类研究生与本科生的一门重要技术课程。学习该课程，对拓宽科研视野、多途径解决课题主攻点具有重要意义。