生物化学实验-(第二版)

nbsp;   言
    1993年，原国家医药管理局科技教育司鉴于我国药学高等专科教育一直没有进行
全国性的教材建设，根据国家教委(1991)25号文的要求负责组织、规划高等药学专科
教材的编审出版工作。在国家教委的指导下，在对全国高等药学专科教育情况调查的基
础上，普通高等专科教育药学类教材建设委员会于1993年底正式成立，并立即制订了
“八五”教材编审出版规划。1995年，经100多位专家组、编写组教师和中国医药科技
出版社的团结协作、共同努力，建国以来**套普通高等专科教育药学类规划教材终于
面世了。其后，又根据高等药学专科教育的主要任务是为医药行业生产、流通、服务、
管理**线培养应用型技术人才的需要，立即组织编审、出版了相关的配套教材(实验
指导、习题集)，以加强对学生的实验教学，培养学生的实际操作能力。
    该套规划教材是国家教委“八五”教材建设的一个组成部分。从当时高等药学专科
教育的现实情况考虑，统筹规划、全面组织教材建设活动，为优化教材编审队伍，确保
教材质量，规范教材规格，起到了至关重要的作用。也正因为如此，这套规划教材受到
了药学专科教育的大多数院校的追崇及广大师生的喜爱，其使用情况一直作为全国高等
药学专科教育教学质量评估的基本依据之一，可见这套教材的影响之大。
    由于我国的高等教育近年进行了一系列改革，我国药学高等专科教育变化也较大，
加之教学大纲的不断调整，这套教材已不能满足现在的教学需要，亟需进行修订。但
是，因为原主管部门已不再管理我国药学高等专科教育，加之一些高等药学专科学校已
经合并到其他院校，原普通高等专科教育药学类教材建设委员会已不能履行修订计划。
因此，全国高等医药院校药学类教材编辑委员会接管了这项工作，组成了新的普通高等
专科教育药学类教材建设委员会，组织了这套规划教材的修订，希望修订后的这套规划
教材能够适应当前高等药学专科教育发展的需求。在修订过程中，考虑到高等专科教育
中全日制教育、函授教育、自学考试等多种办学形式，力求使这套教材能具有通用性，
以适应不同办学形式的教学要求。学术是有继承性的，虽然**版的一些作者已经退休
或因为其他原因离开了药学高等专科教育岗位，不能继续参加这套教材的修订工作，但
是他们对这套教材做出了非常重大的贡献，在此，我们谨对他们表示衷心的感谢。
    这套规划教材修订出版后，竭诚欢迎使用本教材的广大读者提出宝贵意见，以便我
们进行教材评优工作，不足之处我们将在以后修订时改正。
    全国普通高等专科教育
    药学类规划教材建设委员会
    2003年12月
实验四sDs一聚丙烯酰胺凝胶电泳法
    测宦蛋白质分子量
    【目的】
    1．掌握SDS—PAGE测定蛋白质分子量的基本原理。
    2．熟悉垂直板型电泳的基本操作技术。
    3．了解标准曲线的制作以及测定蛋白质分子量的方法。
    【原理】
    蛋白质在电场中支持物上的迁移率差异主要取决于样品中各种分子携带的电荷、分
子的大小与形状的差别。要利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定某一物质的分子量，
必须排除电荷、分子形状等因素或使其作用减少到忽略不计的程度，使该物质迁移率的
大小仅仅取决于其分子量的大小。
    1967年，Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入阴离子去垢剂
十二烷基硫酸钠(SDS)后，蛋白质的迁移率将主要取决于其分子量的大小。SDS是一
种阴离子去垢剂，在溶液中能与蛋白质分子的疏水部分定量结合，把多亚基蛋白质拆成
亚单位，并带上阴离子。这些阴离子掩盖了蛋白质分子本身所带的电荷差异，所以
SDS一聚丙烯酰胺电泳(SDS—PAGE)消除了电荷效应，只有分子筛效应，故蛋白质电
泳迁移率完全取决于分子量，迁移率与分子量对数呈线性关系。即可从标准曲线上求得
蛋白质的近似分子量。
【器材】
1．电泳仪
2．垂直板状电泳槽及胶板装置
3．细长头滴管
4．微量加样器和吸头
5．带长针头微量注射器
6．1．5ml的离心管
7．不锈钢药铲
8．小烧杯和大培养皿
9．滤纸和尺子
 【试剂】
    1．凝胶贮备液
    称取丙烯酰胺(Acr)30g，甲叉丙烯酰胺(Bis)0．8g，加蒸馏水溶至100ml，用三
号滤纸过滤，于棕色瓶中413保存，一般可用1个月。
    2．分离胶缓冲液
    称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)36．3g，lmol／L HCl溶液48ml，加双蒸馏水
(ddH20)至80ml使其溶解，调pH至8．9，然后用ddH20稀释至100ml，置棕色瓶中，
4C贮存。
    3．浓缩胶缓冲液    一
    取Tris碱5．98g，lmol／L HCl溶液48ml，加ddH20至80mi，调pH 6．7，用ddH20
稀释至100ml，置棕色瓶中，4C保存。
    4．Tris一甘氨酸电极缓冲液
    称取’Dis 6．0g、甘氨酸28．8g，加ddH20 850ml，调pH至8．3，加ddH20定容至
1000ml，4。C贮存。用时可作10倍稀释。
    5．10％过硫酸铵
    称取过硫酸铵0．5g，加ddH20 5mi，贮于4C保存。
    6．TEMED【四甲基Z,--胺)
    7．10％SDS
    称取SDS 1g，加蒸馏水10ml使其溶解。   
    8．上样缓冲液
    取浓缩胶缓冲液6．25ml、蔗糖10g、SDS 2．0g、溴酚蓝0．1g，甘油20ml，加ddH20
定容至100ml。
    9．考马斯亮蓝染色试剂
    (1)考马斯亮蓝R250染色液浓度为2．5g／L，用甲醇：醋酸：蒸馏水=5：l：5的溶
液配制(V／V)。
    (2)考马斯亮蓝脱色液取冰醋酸7．5ml、甲醇5mi，加ddH20至100mlo
    10．样品和分子量标准蛋白
    样品为人血清。分子量标准蛋白可用细胞色素C、肌红蛋白、γ一球蛋白、碳酸酐
酶、卵白蛋白、白蛋白(人)和转铁蛋白(人)等。
    【操作】    。
    1．玻璃板的准备
    将玻璃板洗涤干净，固定于电泳槽上，0．8％琼脂糖密封边缘。
    2．电泳凝胶制备
    (1)分离胶的制备取凝胶贮备液4．9ml，分离胶缓冲液2．5ml，蒸馏水12．25ml，
10％SDS 0．2ml，TEMED 0．05ml，10％过硫酸铵溶液0．1ml，混匀。立即用细长头的滴
管将凝胶溶液加于玻璃板间，上部用ddH20或30％乙醇(约3～4mm)封面，保持胶面
平整，室温下静置约30～60min。待分离胶凝固后，可看到清晰的胶水界面。此胶浓度
为2．6％。
    (2)浓缩胶的制备用滤纸吸去分离胶上层多余的水，但不要碰破胶面。再用注射
器取浓缩胶缓冲液洗涤胶面数次，即可制备浓缩胶。
    取凝胶贮备液lml，浓缩胶缓冲液1．25ml、ddIH2O120 7．5ml、10％SDS 0．1ml、
TEMED 0．05ml、10％过硫酸铵0．1ml，混匀后，立即用细长头滴管将凝胶溶液加到分离
胶的上方，直至距玻璃板上缘约0．5cm处，再轻轻插入样品梳，静置40min，使其充分
聚合，此胶浓度为2．6％。凝胶聚合后，小心拔去梳子，用去离子水冲洗梳孔以除去未
聚合的丙烯酰胺。在两电极槽中加入10倍稀释的电极缓冲液，即可上样电泳。
    3．样品预处理和加样
    取血清0．1ml、上样缓冲液0．9ml，混匀，在沸水中煮沸5min。用微量注射器将样
品加到梳孔中，上样量一般5～20μl。用同样方法处理已知分子量的标准蛋白质后用微量
注射器依次将样品加到各梳孔，对于未使用的梳孔，*好加上上样缓冲液。
    4．电泳
    上槽接负极，下槽接正极，调电压为8V／cm凝胶(30～50V)，开始电泳，当待测样
在浓缩胶部分浓缩成一条线后，将电压增加到15V／cm凝胶(60～100V)，继续电泳直至
染料抵达距分离胶下端约1cm处，停止电泳，断开电源。
    5．考马斯亮蓝11250染色
    电泳结束后，取出电泳胶模，移去固定框，用不锈钢药铲轻轻将一块玻璃板撬开移
去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中。精确量取并记录分离胶胶
长度和指示染料的迁移距离(分离胶上缘到染料条带中心距离)。然后将凝胶板浸入考马
斯亮蓝染色液中染色1h，再用脱色液脱色1～2天，直至背景无色为止。
    6．校正曲线的数据处理和分子量测定
    精确量取并记录染色后凝胶长度、各已知分子量标准的蛋白质和各待测蛋白质区带的
  迁移距离(分离胶上缘到各蛋白质区带中心)。按下式计算各蛋白质的相对迁移率(Rf值)：
      蛋白质染色区带迁移距离×染色前凝胶的长度
    kf一  指示染料的迁移距离×染色后凝胶的长度
    分别求得已知分子量标准的蛋白质和样品蛋白质的Rf值后，在半对数纸上，以分子
  量的对数为纵坐标、以各标准蛋白质的Rf值为横坐标作图，可得一条分子量标准曲线。
  根据各待测蛋白质的Rf值，查此曲线，可求得各待测蛋白质的相对分子量(表3—3)。
表3—3标准蛋白分子量及对数值