抗念珠菌肽作用机制

**章嗜铬粒蛋白A衍生抗菌肽 **节抗菌肽概述 抗菌肽（antimicrobial　peptide，AMP）是生物在生存过程中为适应外界环境，由基因编码、核糖体合成的具有抗菌活性的多肽，是生物体防御系统的重要组成部分。由于抗菌肽具有多重抑菌作用方式，使病原菌不易产生耐药性，这一优势使抗菌肽成为治疗临床感染极具潜力的候选药物。深入了解抗菌肽的特性与分类，将有助于抗菌肽药物的研究与开发。 一、抗菌肽的特性与分类 （一）抗菌肽的特性 1974年，瑞典科学家Boman等将大肠杆菌注射到天蚕体内，发现大肠杆菌能诱导天蚕的免疫反应[1]；1981年，其同事Steiner等从大肠杆菌免疫天蚕体内分离出两种具有抗菌活性的碱性多肽。研究发现，两种多肽具有相似的结构，Steiner等将它们命名为Cecropins，这是人类昀早发现的抗菌肽[2]。后续研究表明，抗菌肽广泛存在于生物界，具有净正电荷的共同特征和形成两亲性结构的能力，是包括人类在内的许多物种固有免疫系统的重要组成部分[3]。天然抗菌肽通常在微摩尔浓度下就能抑制细菌或真菌，包括耐药菌株的生长，但对宿主细胞无毒。抗菌肽结构多样，都含有阳离子和疏水氨基酸，易与微生物细胞质膜结合[3]。抗菌肽一般由10～50个氨基酸组成，分子质量小，具有热稳定性和酸碱稳定性，部分抗菌肽还能够抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶水解。 与传统抗生素相比，抗菌肽具有多靶点、弱作用力的特点。传统抗生素通过破坏微生物生长或生存必需的生理功能，如阻断细菌蛋白质的合成或改变酶活性发挥杀菌作用，而细菌只要改变一种基因就足以对抗抗生素的这种作用。抗菌肽则首先作用于病原菌细胞膜，导致膜通透性增大；进入细胞后，还可以与多种细胞内物质相互作用，尤其是线粒体，使线粒体功能失常。因此，细菌必须改变相当部分基因才能抵抗抗菌肽的进攻，而这几乎是不可能的，故抗菌肽产生耐药性的可能性较小。抗菌肽只对原核生物细胞和真核生物病变细胞有抗菌作用，对正常的真核生物细胞不起作用。原因在于原核生物和真核生物的细胞膜结构不同，真核生物细胞膜中含有大量胆固醇，胆固醇的存在使膜结构趋于稳定。肿瘤细胞的细胞骨架系统与正常细胞相比不发达，这可能是抗菌肽对肿瘤细胞也具有抑制作用的原因之一。高等动物细胞存在高度发达的细胞骨架系统，其存在可以抵抗抗菌肽的作用。抗菌肽具有广谱抗菌活性，可以抗细菌、真菌、病毒、原虫，部分抗菌肽还具有抗肿瘤活性。此外，有些抗菌肽还具有促进创伤愈合和血管生成、中和或阻断内毒素、免疫调节和免疫抑制等功能。因此，抗菌肽有望开发成为一类新型、高效的抗菌药物或辅助治疗药物[4]。 科研工作者对已报道抗菌肽进行收集、归纳、整理，建成了抗菌肽数据库。目前，国际上有多个影响较大的抗菌肽数据库，如APD数据库、DRAMP数据库CAMPR3数据库等。截至2020年8月19日，APD数据库已收录3240种抗菌肽，其中2405种来自动物、360种来自植物、358种来自细菌、20种来自真菌、8种来自原生生物、5种来自古生菌，还有一些合成肽。对APD数据库中的3240种抗菌肽生物活性进行分析，发现抗菌肽功能多样。根据其生物学活性进行分类，不同活性抗菌肽及其在3240种抗菌肽中所占比例见表1-1。由表1-1可知，在收集的活性肽中，抗细菌肽占比昀高（83.67%），其次是抗真菌肽（37.16%），抗念珠菌肽位居第三，占20.77%。 （二）抗菌肽的分类 抗菌肽广泛存在于微生物、植物和动物中。动物和植物产生的抗菌肽研究比较成熟，大多都已知其抗菌机制；微生物中研究较多的是细菌产生的抗菌肽，对酵母、霉菌和藻类产生的抗菌肽研究较少。根据来源不同，抗菌肽大致分为动物源抗菌肽、植物源抗菌肽、微生物源抗菌肽和人工设计合成的抗菌肽。 1.动物源抗菌肽 （1）哺乳动物源抗菌肽来源于哺乳动物的抗菌肽，大致分为Defensins家族（防御素家族）、Cathelicidins家族和Bactenecins家族。 Defensins家族是一类富含二硫键的阳离子型多肽，不仅存在于动物体内，也广泛分布于真菌和植物中，是生物免疫系统中的防御分子[5]。防御素抗菌谱广，具有直接杀菌功能，是一类重要的抗菌肽，根据结构分为α-Defensins、β-Defensins、θ-Defensins三类，其区别主要是二硫键位置不同。其中α-Defensins和β-Defensins的数量*多。 Cathelicidins是一类具有广谱抗微生物活性的多功能抗菌肽，在几乎所有种类的脊椎动物体内均有发现，在动物先天免疫系统中发挥极其重要的作用。Cathelicidins对普通革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌以及病毒具有非常强的抗性，具有杀菌功能，不易产生耐药性。此外，Cathelicidins无分子内二硫键，结构简单，溶血活性和细胞毒性小[6]。 Bactenecins家族是分离自牛中性粒细胞的防御多肽，是由中性粒细胞内大颗粒中的蛋白前体加工形成的阳离子抗菌肽[7]，具有广谱杀菌功能，是宿主免疫系统中的重要防御分子。 （2）两栖动物源抗菌肽 两栖动物皮肤在自然进化过程中形成了防御病原微生物的三套防御系统。皮肤抗菌肽是两栖动物先天性防御系统的主要组成部分。两栖动物皮肤抗菌肽具有高效、广谱、不易产生耐药性等特点[8]，一般由11～47个氨基酸残基组成，除Distinctin为两条肽链外，其他的蛙皮抗菌肽分子都是一条肽链。两栖动物源抗菌肽抗菌活性具有广谱性，不仅对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有良好抗菌活性，对真菌、病毒等也具有生物学活性。研究昀多的两栖动物源抗菌肽来源于蛙科。 （3）海洋动物源抗菌肽 海洋中有非常丰富的物种资源。从海洋动物中分离出的抗菌肽种类较多，包括从无脊椎动物和鱼类中分离的抗菌肽等。来源于海洋无脊椎动物的抗菌肽，一般分子质量小于10kDa，且具有两亲性。这些抗菌肽一部分来源于甲壳类，一部分来源于贝类，还有一部分来源于海鞘类。甲壳类抗菌肽大多数提取自甲壳动物的血细胞和浆细胞[9]。贝类抗菌肽中报道昀多的是贻贝类抗菌肽，如从紫贻贝中提取的DefensinA和DefensinB、从地中海贻贝中提取的MGD-1和MGD-2等。海鞘类抗菌肽中研究比较多的是HalocyamineA，对多种细菌和真菌具有抑菌活性。来源于鱼类的抗菌肽，大多数分离于鱼类的表皮黏液中，还有部分来自于鱼类的各种组织脏器，其分子质量多集中在2～10kDa，结构多为α螺旋，具有两亲性特征。 （4）鸟源抗菌肽 鸟源抗菌肽较少。这类抗菌肽大多与哺乳动物β-Defensins同源，如从鸡的异嗜白细胞中提取的Gallinacins等[10]。 （5）昆虫源抗菌肽 截至目前，从昆虫体内发现了200多种抗菌肽。昆虫源抗菌肽根据其氨基酸序列和结构特性，分为α螺旋结构的抗菌肽、可以在内部形成二硫键的抗菌肽、富含脯氨酸（Pro）的抗菌肽和富含甘氨酸（Gly）的抗菌肽。 目前已成功分离出60多种α螺旋结构的抗菌肽，这些抗菌肽不含二硫键和半胱氨酸（Cys）[11]。Cecropins和Andropins是两种具有代表性的α螺旋抗菌肽。Cecropins主要对革兰氏阴性菌发挥作用，可以溶解细菌细胞膜。Andropins主要对革兰氏阳性菌发挥作用，对革兰氏阴性菌几乎无作用[12]。Apidaecins和Abaecin是两种典型的、含脯氨酸的抗菌肽，均来自于蜂类昆虫。目前，已发现的富含脯氨酸的抗菌肽有7种[13]。SarcotoxinII是一种典型的、富含甘氨酸的抗菌肽，来源于麻蝇，是目前发现的昆虫源抗菌肽中分子质量昀大的肽，分子质量可达30kDa，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较好的活性[14]。 蜂毒肽（melittin）是提取自蜂类毒液中的一种高活性肽，由26个氨基酸残基组成，氨基酸序列为NH2-GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-COOH，分子质量为2847.5Da[15]。蜂毒肽是一种阳离子肽，具有两亲性结构特征，生物学活性高，不仅能够抗菌，还能够抗肿瘤、抗病毒、抗炎和镇痛等[16]。蜂毒肽在发挥作用时，会破坏微生物的细胞膜，从而使磷脂双分子层结构崩解。 2.植物源抗菌肽 植物源抗菌肽是一类对细菌、真菌等微生物有抑制或杀灭作用的小分子多肽，被细菌、真菌或物理的、化学的刺激所诱导产生，有些抗菌肽甚至在植物体内能组成型表达。从化学结构来看，植物源抗菌肽主要包括硫堇（thionins）、植物防卫素（Defensins家族）、脂转移蛋白（lipid　transfer　protein，LTP）和橡胶素（hevein）等抗菌肽家族。植物源抗菌肽抗菌能力强，有较好的耐热性。 3.微生物源抗菌肽 （1）细菌源抗菌肽 细菌源抗菌肽是由细菌产生的抗性代谢产物，是在代谢过程中通过核糖体合成的一类能够抑制和杀死竞争菌的多肽，又称细菌素（bacteriocin），主要包括地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌产生的杆菌肽（bacitracin）、短芽孢杆菌产生的短杆菌肽S（gramicidinS，GS）和多黏芽孢杆菌产生的多黏菌素（polymycin）等。细菌素具有不易产生耐药性、无危害等特点，是食品防腐保鲜方面良好的天然防腐剂[17]。产生细菌素的细菌通常称为益生菌。细菌素通常是一类具有疏水性或两亲性的阳离子肽。 （2）病毒源抗菌肽 慢病毒裂解肽（lentiviral　cleavage　peptide，LLP）为人类免疫缺陷病毒1型跨膜蛋白的离散C端序列，具有很强的抗菌活性。LLP二聚体Bis-LLP对Serratiamarcescens的细菌外膜和胞质膜均有破坏作用，表现出很高的细胞毒性[18]。 4.人工设计合成抗菌肽 生物体内的天然抗菌肽含量较少，因而提取难度大、分离纯化效率低、分离成本高，影响了抗菌肽的规模化生产。天然抗菌肽自身还存在生物活性低、代谢稳定性差等问题。为了解决这些问题，快速获得活性高且稳定的抗菌肽，科研工作者开始人工设计合成抗菌肽[19]。常用的合成抗菌肽方法主要有3种，分别是固相合成法、片段法和组合化学法。 （1）固相合成法合成抗菌肽 该法采用惰性固体树脂作为载体，运用氨基酸脱水缩合原理合成抗菌肽。树脂上的氨基基团（—NH3）与氨基酸的羧基基团（—COOH）在缩合剂的作用下连接，除去氨基酸的氨基保护基团，暴露氨基酸的—NH3，与下一个氨基酸的—COOH相连；重复此步骤，直到昀后一个氨基酸连接上去，然后使用切割液将合成的肽切割下来，即得到抗菌肽粗品。化学合成抗菌肽是从羧基向氨基方向合成，这与肽的生物合成方向不同。根据氨基酸氨基保护基团的类型，固相合成法又分为Boc合成法和Fmoc合成法。目前应用昀多、昀广泛的是Fmoc合成法。该方法比较温和，对实验条件要求不高，普通实验室就可以进行合成。 （2）片段法合成抗菌肽 该方法起源于固相合成法，又称为“片段连接法”，适用于合成较长的肽段。简单来说，片段法就是先将完整的肽段分成小段肽段，然后分段合成，再将这些肽段在溶液或者树脂上按顺序连接起来，形成一个完整的肽段。这种方法比较耗时，且成本较高，但当组成抗菌肽的氨基酸残基数较多时，该方法是合成抗菌肽的唯一办法。 （3）组合化学法合成抗菌肽 组合化学法也称为“组合库”或“自动合成法”。该方法的核心思想是把一类化学结构相似、性质不同的化学单体作为合成材料，让其在同一种条件下进行反应，根据一定的组合规律，得到多种类型的化学物质。可以通过使用组合库研究抗菌肽结构与功能的关系，进而发现新型抗菌肽。 二、抗菌肽理化特性 抗菌肽（AMP）作为小分子活性物质，多由6～50个氨基酸组成，平