病原生物与医学免疫学实验(第4版)

绪 言 一、 病原生物学与免疫学实验目的和要求 (1) 通过实验观察和实验操作，巩固并加深对医学免疫学和病原生物学基本理论知识的理解。 (2) 掌握病原生物学与免疫学的基本操作技术;树立牢固的无菌观念，掌握生物安全的基本知识和病原生物学中常见的无菌操作技术，为以后的临床操作奠定坚实的基础。 (3) 熟悉感染性疾病常用的诊断方法和手段，了解病原生物学和免疫学实验技术的新进展。 (4) 培养学生具有从事科学实验的能力，能够独立观察实验结果、整理分析实验资料、总结书写实验报告和论文的能力。 培养学生一定的创新能力，能够提出问题，分析问题并设计方案解决问题。 培养学生严谨的科学态度和作风，培养学生不仅具有独立解决问题的能力，同时也培养学生团结协作精神。 二、 实验室生物安全 国家根据病原微生物的传染性、感染后对个体或者群体的危害程度，将病原微生物分为四类(表 0-1): 一类、二类病原微生物统称为高致病性病原微生物。 根据微生物实验室开展工作的性质、接触的病原体生物危害程度、采取生物安全措施的不同分为 4 级(表 0-2) 三、 实验室规章制度 病原生物学实验的对象大多为病原微生物，有的具有一定的感染性，因此要求进入实验室后必须严格遵守以下实验室规则: (1) 每次进入实验室必须穿白大褂，不必要的物品不得带入实验室，必须带入的书籍和文具等应放在实验台下的抽屉里，以免受到污染。 (2) 实验室内禁止饮食、喝水、抽烟，不得高声谈笑或随便走动，务必关闭手机铃声，上课期间不得使用手机。 (3) 各种实验物品应按指定地点存放，用过的器材必须放入消毒缸内，禁止随意放于桌上及冲入水槽。 (4) 须送培养箱培养的物品，应做好标记后送到指定地点。 (5) 实验过程中发生差错或意外事故时，应立即报告老师，并在老师的指导下进行正确的处理，禁止隐瞒或擅自处理。 如有传染性的材料污染桌面、地面等，应立即用规定浓度的消毒液浸泡污染部位，作用 5 ~ 10min 后方可抹去。 如手被活菌污染也应使用合适浓度的消毒液浸泡 5 ~ 10min 后，再以自来水反复冲洗。 (6) 爱护室内仪器设备，严格按照仪器的操作规则使用，尤其是显微镜，使用油镜头后必须擦净镜油。 节约使用实验材料，不慎损坏了器材等，应主动报告老师并进行相应清理。 (7) 实验完毕，应物归原处，并将桌面整理清洁，实验室打扫干净。 *后以消毒液浸泡手 5min，清水洗净后方可离开实验室。 **篇 基 本 实 验 **章免疫学基本实验 **节抗体的制备 抗体(antibody，Ab)是免疫系统在抗原的刺激下，B 淋巴细胞转化为浆细胞，由浆细胞所产生的、能与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。 抗体在疾病的诊断和防治中发挥重要作用，人工制备抗体是大量获得抗体的重要途径。 人工制备抗体的类型主要有多克隆抗体( polyclonal antibody，Pc Ab)、单克隆抗体( monoclonal antibody，Mc Ab)和基因工程抗体(gene engineering antibody，Ge Ab)。 本书主要介绍多克隆抗体和单克隆抗体的制备方法。 一、多克隆抗体 多克隆抗体(polyclonal antibody，Pc Ab) 是指多种抗原决定簇的抗原免疫动物，刺激机体多个 B 细胞克隆，产生针对多种抗原表位的不同抗体，所获得的抗体为多种抗体的混合物，即多抗。 为制备高效价、高特异性的多克隆抗体，须有理想的免疫原、适宜的动物和可行的方法。 本书主要介绍大肠埃希菌抗血清制备的多克隆抗体。实验 1-1 多克隆抗体的制备 【实验目的】 制备高效价高特异性的免疫血清可为免疫学诊断特异性免疫治疗和免疫学实验提供常用的试剂。 【实验原理】 将抗原导入敏感动物体内后，刺激其淋巴结和脾脏中的淋巴细胞等网状内皮细胞系统大量增殖。 实验动物对初次免疫和二次免疫的应答不同。 初次免疫应答较弱，特别是对易代谢，可溶性的抗原。 首次注射后 7d 左右，在血清中可以检测到抗体，其浓度维持在一个较低水平;注射后 10d 左右抗体的滴度会达到*大值。 这种抗体滴度增加，血清中抗体种类和性质发生改变称为免疫应答的成熟，在抗体的制备过程中具有重要的实际意义。 通常在抗原注射 4 ~ 6w 后会产生具有高亲和力的抗体。 免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。 三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似。 【实验材料】 家兔、大肠埃希菌、SS 平板、固体斜面培养基、固体营养培养基、接种环、酒精灯、玻璃过滤器、37℃培养箱、摇床恒温水浴箱、离心机、振荡器、灭菌大试管、毛细管、玻片、0． 5% 石炭酸溶液、硫柳汞溶液、饱和硫酸铵溶液、磷酸、盐缓冲液、盐酸溶液、氢氧化钠溶液、生理盐水。 【实验方法】 1．抗原的制备 从正常人群的粪便中分离出的大肠埃希菌作革兰染色，革兰染色阴性，符合糖发酵实验阴性标准，SS 平板上菌落典型的菌才能作后续实验。 将分离出的大肠埃希菌接种于固体斜面培养基纯培养。 再将其接种于固体营养培养基平板，置 37℃ 培养箱培养 16 ~ 18h 后用无菌生理盐水洗下菌苔，充分摇匀。 将此悬液作革兰染色镜检，如未检测到杂菌，将其加热至 80℃ 30min，玻璃滤器滤过，上面得 O 菌液，下面得 H 菌液，将菌液稀释至约 10 亿/ m L 浓度，置 4℃冰箱待用。 2． 免疫方法 选择并标记雄性家兔 10 只，O 菌液与 H 菌液各注射注射 5 只。 3． 血清制备 末次注射后 5 ~ 7d，从兔耳静脉采血 2m L，分离血清。 用试管凝集定量法测定抗体效价，如效价达 1 ∶ 1 万以上，则以无菌操作从兔心脏抽血，分离血清，于 56℃ 保温30min，以灭活补体。 在血清中加入适量的 0． 5% 石炭酸作防腐剂，分装成每小瓶 1 ~ 2m L，密封，做好标记，置于 4℃冰箱保存备用。 【实验结果】 将免疫后收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检测是否有抗体产生及抗体的效价。 用抗大肠埃希菌 H、O 血清，作玻片凝集试验，肉眼及镜下观察，该现象与伤寒杆菌凝集现象不易区分。 将 H、O 混合后血清适当稀释代替伤寒病人血清，将大肠埃希菌 H、O 菌液代替伤寒菌液作肥达反应，其现象与临床肥达反应不易区分。 【注意事项】 (1) 抗原的质量很关键，增强抗原的免疫原性不能破坏其本身的抗原表位; (2) 混合抗体的制备需要适当选择抗原簇以免制成的混合抗体不能检出规定的细菌而造成漏检; (3) 制备抗原须灭活细菌，抗体制备须研究抗原的注射剂量、注射时间和取血时间，避免抗原制备失败或抗体效价不理想; (4) 若血清抗体效价检测未达到要求，可加强免疫一次; (5) 免疫后的动物要密切监测动物的身体状况若出现超敏反应、皮肤溃烂等问题要及时处理。实验 抗体的提取与纯化(盐析沉淀法)一般抗体提取与纯化的操作程序是为多克隆抗体血清设计的，主要的方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法与梯度离心法，在实际应用中多在抗体的产量与纯度之间考虑一合理的方法。 本次实验选用盐析法，此法简便，产量高，但纯度稍差。 【实验目的】 用盐析法纯化抗血清。 【实验原理】 此法提取抗体，是根据蛋白质具有胶体性质，当蛋白质溶液中加入大量中性盐类时，夺取蛋白质水化层使其脱水，并中和蛋白质所带电荷，使蛋白质失去稳定因素而从溶液中沉淀出来，但并不引起蛋白质发生变性，此现象称盐析。 由于各种蛋白质析出时所要求盐类浓度不同，因此在蛋白质溶液中加入不同浓度的中性盐，能使各种成分蛋白质分别析出，达到分离提纯抗体的目的。 【实验材料】 饱和硫酸铵溶液(p H7． 0)、免抗人 Ig G 免疫血清、p H7． 4 0． 01mol/ L PBS(含 0． 14 mol/ LNa Cl)、奈氏试剂、透析袋、离心机、磁力搅拌器、小烧杯、离心管。 【实验方法】 (1) 每组于小烧杯中加入抗血清 5m L、PBS 5m L，在搅拌器上边搅拌边逐滴缓慢加入饱和硫酸铵 10m L，逐渐发生混浊。 分装 2 支 10m L 离心管，4℃ 30min 或过夜。 (2) 3000rpm 20 ~ 30min(*好 4℃)，去上清，共用 5m L PBS 将两支离心管的沉淀溶解并吸于一支离心管中。 加饱和硫酸铵 2． 5 m L 使其蛋白质沉淀，4℃30min(33% 硫酸铵饱和度)。 此步重复 1 ~ 2 次。 (3) 3000rpm 20 ~ 30min， 去 上 清， 用 少 量 PBS 溶 解， 吸 入 透 析 袋 内， 用 无 Na Cl0． 01mol/ L PBS 4℃ 透析去盐，每天换液 3 次(在磁力搅拌下透析更快)，到除尽溶液中的NH4为止，约需 2 ~ 3d。 透析液 NH4的检测用奈氏试剂，如产生黄色沉淀证明 NH4存在。 (4) 可用葡聚糖 G-25 或 G-50 凝胶过柱除盐并进一步纯化。 (5) 紫外分光光度计读 OD280值，了解抗体蛋白质含量。 小量分装，-20℃保存。 二、 单克隆抗体 单克隆抗体(monoclonal antibody，Mc Ab)是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。 单抗在结构和组成上高度均一，抗原特异性及同种型一致，易于体外大量制备和纯化，故单抗具有纯度高、特异性强、效价高、少或无血清交叉反应、制备成本低等特性，已广泛应用于疾病的诊断、特异性抗原或蛋白的检测和鉴定、疾病的被动免疫治疗和生物导向药物的制备等。要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆 B 淋巴细胞，但这种 B 淋巴细胞不能在体外生长。 而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。 这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有 B 淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体(图 1-1，彩图)。图 1-1 单克隆抗体制备过程示意图(一) 抗原提纯与动物免疫 对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。 如为细胞抗原，可取 1×107个细胞作腹腔免疫。 可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。选 择 与 所 用 骨 髓 瘤 细 胞 同 源 的BALB/ c 健康小鼠，鼠龄在 8 ~ 12w，雌雄不限。 为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫 3 ~ 4 只小鼠。免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为*终目的。 免疫间隔一般 2 ~ 3w。 一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大，而且单克隆抗体的质量(如抗体的浓度和亲和力)也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。 末次免疫后 3 ~4d，分离脾细胞融合。 (二) 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 选择瘤细胞株的*重要的一点是与待融合的 B 细胞同源。 如待融合的是脾细胞，各种骨髓瘤细胞株均可应用，但应用*多的是 Sp2 / 0 细胞株。 该细胞株生长及融合效率均佳，此外，该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。 细胞的*高生长密度为 9×105/ m L，倍增时间通常为 10 ~ 15h。 融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞(活性应大